抗大鼠肾小球基底膜肾炎模型建立方法的改进.docx

抗大鼠肾小球基底膜肾炎模型建立方法的改进【摘要】 目的 探讨快速建立抗大鼠肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)肾炎动物模型的方法。方法 30只正常SD大鼠随机分为三组，肾炎模型A、B组和正常对照组。肾炎模型A、B组大鼠一次性尾静脉注射兔抗GBM血清；正常对照组，尾静脉注射等量正常兔血清。肾炎模型A组大鼠尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清前一周，通过足垫皮内注射正常兔血清进行预免疫。上述三组大鼠于尾静脉注射兔血清后第2、7、14和21天，检测24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮含量；第21天处死大鼠取肾组织观察肾小球和肾小管的病理变化。结果 肾炎模型A、B组，尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清后，24h尿蛋白，血肌酐和血尿素氮含量均明显升高(P)，A组升高程度均较B组明显(P)。光镜检测A组新月体形成率较B组明显升高，肾小管内蛋白管型较B组多，部分肾小球不完全纤维化，B组肾小球未见纤维化。对照组上述指标均无明显变化。结论 大鼠注射兔抗GBM血清之前，进行正常兔血清预免疫，可以更快诱导大鼠产生抗GBM肾炎。【关键词】 抗GBM肾炎模型方法大鼠 【Abstract】 Objective To approach the fast method to establish rat models of anti-GBM30 normal rats were randomly divided into nephritis group A, nephritis group B and control group. The rats in nephritis groups were injected of rabbit anti-rat GBM serum. The rats in nephritis group A were preimmunized subcutane of normal rabbit serum 7 days before the injection of rabbit anti-rat GBM serum. All rats were observed for 24h urinary protein, serum creatine, serum urea on the 2nd day, the 7th day, the 14th day and the 21st day. All rats were killed on the 21st day and the kidney specimens were collected for histologic analysis. Results The 24h urinary protein, serum creatine and serum urea were obviously increased in the rats injected with rabbit anti-GBM serum (P), especially in nephritis group A (P). There were more crescents and protein casts in nephritis group A than group B and part of the glomerule was partial fibrous degeneration in nephritis group A. There was no fibrosis observed in nephritis group A and no marked changes at all the above time points in control group. Conclusions The rats can be fast induced to the anti-GBM nephritis by preimmunizing with normal rabbit serum before injecting the rabbit anti-rat GBM serum. 【Key words】 Anti-GBM nephritis; model; method; rat 新月体性肾炎是人类肾小球肾炎中常见病、多发病。临床上多数患者起病急、病情凶险、病程迅速、预后较差。该病是一种自身免疫性疾病，其病理特征为大部分肾小球内形成新月体，早期为细胞型新月体，随着炎症发展，细胞型新月体逐渐转变为纤维性新月体，最终可导致整个肾小球纤维化，肾功能丧失。 大鼠抗GBM肾炎是利用异种抗大鼠GBM抗体直接诱导发生的具有典型的人类新月体性肾炎病理变化的动物模型。单纯注射抗GBM血清诱导的大鼠抗GBM肾炎，病程发展较慢，形成典型的新月体性肾炎需时较长。本实验在原来的实验基础上有所改变，先对大鼠足底注射正常兔血清进行预免疫，1周后再注射兔抗大鼠GBM血清，建立大鼠抗GBM肾炎模型，探讨一种快速建立典型的新月体性肾炎动物模型的方法，以期为进一步研究人类新月体性肾炎提供实验依据。 1 材料与方法 动物 正常健康SD大鼠，190210g，徐州医学院实验动物中心提供。主要试剂 兔抗大鼠GBM血清，本实验室制备，胶原酶、完全福氏佐剂购自上海华美生物工程有限公司。大鼠抗GBM肾炎模型的复制及动物分组处理 正常SD大鼠30只，雌雄不限，180220g，实验前在本实验室饲养4天，以适应环境。在此期间单笼收集大鼠24h尿，测24h尿蛋白含量，心脏穿刺采血收集血清测血肌酐和尿素氮含量，30只大鼠的上述指标均无异常。大鼠随机分为三组，肾炎模型A组、肾炎模型B组及正常对照组，每组10只。肾炎模型A、B组大鼠一次性尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清；正常对照组大鼠尾静脉注射等量正常兔血清，剂量均为1ml/100g。肾炎模型A组大鼠尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清前1周，足垫皮内注射兔正常血清进行预免疫，正常兔血清与完全福氏佐剂等量混合，总体积为。主要观察指标生化指标 于尾静脉注射兔血清后第2、7、14天和第21天，收集24h尿，采用改良Lowry法测24h尿蛋白含量；心脏采血收集血清，采用苦味酸法测血肌酐含量，二乙酰一肟法测血尿素氮含量。病理学检查 于尾静脉注射兔血清后第21天，处死大鼠取肾组织进行光镜及电镜检查。肾组织切片经H-E染色，光镜观察肾小球体积大小、肾小球内细胞数及肾小管内蛋白管型等情况，肾小球尿囊腔内可见三层细胞为形成新月体，计数50个肾小球，统计新月体形成率。电镜观察肾小球基底膜变化、肾小球内电子致密物沉积、足突融合等情况。统计学处理 所有数据均以xs表示，采用t检验，为统计学差异有显着性。 2 结果 24h尿蛋白含量的变化 肾炎模型A、B组大鼠，尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清后，各时间点24h尿蛋白含量均较正常对照组明显升高(P)，A组第2、7天和14天尿蛋白含量较B组明显升高(P)，A组于第21天尿蛋白含量有下降趋势。注射正常兔血清后，正常对照组大鼠24h尿蛋白含量无明显改变，见表1。表1 大鼠注射兔血清后各时间点24h尿蛋白含量注:与正常对照组相比*;A组与B组相比血肌酐含量的变化 尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清后，肾炎模型A组大鼠第7、14天和21天血肌酐含量较正常对照组明显升高(P)，肾炎模型B组大鼠第14天和第21天血肌酐含量较正常对照组明显升高(P)。肾炎模型A组大鼠第14天和第21天血肌酐含量较B组明显升高(P)。N组大鼠血肌酐含量无明显改变，见表2。表2 大鼠注射兔血清后各时间点血肌酐含量注:与正常对照组相比* ;与正常对照组相比*; A组与B组相比;A组与B组相比血尿素氮含量的变化 尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清后，肾炎模型A组大鼠第7、14天和21天血尿素氮含量较N组明显升高(P)，肾炎模型B组大鼠第21天血尿素氮含量较N组明显升高(P)。肾炎模型A组大鼠第14天和第21天血尿素氮含量较B组明显升高(P)。N组大鼠血尿素氮含量无明显改变，见表3。表3 大鼠注射兔血清后各时间点血尿素氮含量注:与正常对照组相比*;与正常对照组相比*; A组与B组相比;A组与B组相比病理检查 尾静脉注射兔抗大鼠GBM血清后第21天，肾炎模型A组大鼠新月体形成率为45%，部分肾小球尿囊腔完全闭塞，少数肾小球不完全纤维化，肾小管内可见大量蛋白管型(见图1、2)。肾炎模型B组大鼠新月体形成率为13%，肾小管内蛋白管型较A组少，肾小球未见纤维化(见图3)。电镜观察肾炎模型A组肾小球基底膜明显增厚，内皮下大量电子致密物沉积，足突大片融合(见图5)。肾炎模型B组肾小球基底膜增厚不明显，内皮下可见少量电子致密物沉积，足突局部融合(见图6)。对照组大鼠肾组织无明显变化(见图4、7)。3 讨论 人类新月体性肾炎是一种自身免疫性疾病，发病机制较为复杂，其病理特征为大部分肾小球伴有新月体形成，早期的新月体主要由浸润的巨噬细胞和增生的肾小球囊上皮细胞组成，随着炎症的发展，细胞型新月体逐渐转变为纤维型新月体，最终导致整个肾小球纤维化，肾功能丧失。 大鼠抗GBM肾炎通过注射异种抗大鼠GBM抗体诱导产生，其病变如细胞增生、炎症细胞的浸润、纤维蛋白的渗出及新月体的形成、GBM不规则增厚和断裂等病理变化均与人类新月体性肾炎相似。该模型具有重复性好和制作容易等特点，在研究新月体性肾炎的发病机制及探讨疾病的防治措施等方面，一直被广泛采用。但是单纯注射抗GBM血清诱导的大鼠抗GBM肾炎，病程发展较慢，形成病变典型的新月体性肾炎需时较长。在本实验中，肾炎模型A组大鼠在注射兔抗大鼠GBM抗体之前，先通过足底皮内注射正常兔血清进行预免疫，肾炎模型B组大鼠仅注射兔抗大鼠GBM抗体，实验结果显示肾炎模型A组24h尿蛋白含量、血肌酐及血尿素氮含量升高均较B组出现早，且升高程度较B组明显，肾炎模型A组24h尿蛋白含量在第21天有下降趋势，其原因可能是随着炎症细胞浸润并活化及纤维蛋白等炎性因子的参与，促使肾小球纤维化进行性加重，尿囊腔压力增大，在一定程度上阻止了蛋白的外漏，另一方面大量蛋白管型使肾小管堵塞，大量蛋白淤积于肾小球内，加剧肾小球纤维化，肾功能急剧下降。病理结果显示肾炎A组大鼠新月体形成率较B组明显高，而且病理变化更典型。这些结果说明肾炎A组较B组肾炎症状出现早，病程发展快，这和临床上新月体性肾炎的急性进行性特征更为一致。 大鼠抗GBM肾炎有两个免疫时相，即异体免疫时相和自体免疫时相1。异体免疫时相是指兔抗大鼠GBM抗体注射到大鼠体内后，兔抗GBM抗体迅速固定于大鼠GBM上，通过激活补体及其他一系列途径25，损伤大鼠的GBM，此时相持续710天。自体免疫时相包括两个方面：一方面是指大鼠体内产生抗兔免疫球蛋白的抗体，并与沉积在GBM上的兔免疫球蛋白结合，导致沉积的IC继续扩大，加重肾组织的病理损害6；另一方面因大鼠肾组织损伤而导致自身隐蔽抗原的释放，如GBM等，从而诱导自身免疫细胞损伤GBM78，大鼠GBM损伤，导致蛋白尿，炎性细胞浸润，新月体形成等。在肾脏病理损伤中，自体免疫发挥主要作用。 通过皮内注射正常兔血清，经过一段时间，大鼠体内可以产生针对兔免疫球蛋白的抗体及致敏淋巴细胞。当兔抗大鼠GBM血清注射到大鼠体内时，兔抗大鼠GBM抗体与GBM结合后，大鼠体内的针对兔免疫球蛋白的抗体及反应性T细胞可以在很短时间内与结合在大鼠GBM上的兔抗GBM抗体发生免疫反应，同时引起GBM的损伤, 此损伤更快速且更严重。在肾炎模型B组中自体免疫时相发生在异体免疫时相之后，只有在大鼠产生抗兔血清的抗体后，或是自身GBM受损暴露后才会发生自体免疫应答。肾炎模型A组通过预免疫，提前使大鼠体内生成兔免疫球蛋白的抗体及致敏淋巴细胞，自体免疫时相较肾炎模型B组发生较早，相应引起的免疫损伤也较严重，因此肾炎症状出现更早，能在较短时间内诱导大鼠产生典型新月体性肾炎病理改变。 本实验通过预免疫，在较短时间内诱导大鼠产生典型的新月体性肾炎动物模型，以期为进一步研究人类新月体性肾炎提供实验依据。 【参考文献】 1 汤仁仙，简洁，王迎伟,等.大鼠抗GBM肾炎模型的建立及不同病期的生化指标和肾组织病理学观察.徐州医学院学报，2003,23(1): 9-13. 2 Le Hirof humorally mediated anti-glomerular basement membrane (GBM) glomerulonephritis in mice. 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