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浅析HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响
【摘要】 　　目的: 研究HPV18 E2及其N端(TAD)、 C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞凋亡及分泌活性的影响, 为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础。方法: 通过PCR从现有真核表达载体pEGFPC1/E2上分别扩增出TAD、 DBD基因片段, 并构建真核表达载体pEGFPC1/TAD、 pEGFPC1/DBD。将3种真核表达载体及pEGFPC1分别转染MΦ, 用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位, 并以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测它们的表达。通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达, 在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNFα和IL1β的含量, 并收集MΦ经染色以及流式细胞术观察检测其凋亡。结果: GFPE2融合蛋白主要表达于细胞核, 细胞质内也有表达, 而GFPDBD融合蛋白仅表达于细胞核内, GFPTAD仅表达于细胞质。GFPE2、 GFPTAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升, 细胞因子TNFα和IL1β分泌量增加, 且GFPTAD作用强于GFPE2。而EGFPDBD无此作用。结论: HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNFα和IL1β。
【关键词】 人乳头瘤病毒18型 E2蛋白 巨噬细胞 凋亡 细胞因子
　　[Abstract] AIM: To study the effect of the over expression of GFPE2, GFPTAD(Nextremity domain of HPV18 E2) and GFPDBD (Cextremity domain of HPV18 E2) on the apoptosis and secretion of macrophages and to further explore the contribution of E2 gene to the uterine cervix cancer. METHODS: TAD or DBD gene was amplified from pEGFPC1/HPV18 E2 by PCR respectively and then cloned into pEGFPC1 vector. After the transfection of recombinant plasmids or pEGFPC1 into the macrophages, thr expression was examined by fluorescent microscopy and Western blot. The cytokine content of TNFα or IL1β in the culture medium was tested quantitatively with ELISA kit respectively. The stained macrophages were observed and thr apoptosis rate was tested by flow cytometry. RESULTS: After transfected into macrophages, GFPE2 fusion protein was mainly located in cytoplasma while GFPDBD fusion protein was completely located in nuclei and GFPTAD fusion protein was completely located in cytoplasma. The overexpression of GFPE2 or GFPTAD increased the level of TNFα and IL1β and upregulate the apoptosis rate of macrophages. Furthermore, the effect of GFPTAD was obvious except on IL1β level but the overexpression of GFPDBD did not show the same effect. CONCLUSION: The overexpression of GFPE2 or GFPTAD fusion protein can induce the apoptosis macrophages and upregulate TNFα or IL1β secretion of macrophages.
　　[Keywords]HPV18; E2 protein; macrophage; apoptosis cytokine
　　人乳头瘤病毒高危型如HPV16、 18等常引起重度不典型性增生,甚至恶性肿瘤。HPV18是一种无包膜的环状病毒, 基因全长7900 bp, 早期基因区编码的E2蛋白由365个氨基酸组成, 分为2个结构域: N端转录活化结构域, 由206 aa组成; C端DNA结合域, 由80 aa组成; 中间是一个可变的铰链区, 由79 aa组成。E2蛋白既调节病毒的转录又调节病毒的复制, 且通过多种途径影响细胞增殖。目前国内外有不少学者将E2蛋白用来研发HPV疫苗。
　　MΦ是机体抗肿瘤免疫中的重要效应细胞, 激活的MΦ可分泌TNFα、 IL1β等细胞因子直接杀瘤或抑制瘤细胞生长。HPV感染后, 在真皮基质可检测到大量的巨噬细胞。尖锐湿疣患者外周血TNFα水平明显高于正常对照组, HPV感染者血浆及宫颈分泌物中IL1β水平也升高。本实验中我们通过检测HPV18 E2蛋白及其TAD、 DBD高表达对MΦ凋亡及其分泌TNFα和IL1β的影响, 为HPV18致癌机制以及E2蛋白相关疫苗的研究奠定前期实验基础。
　　1 材料和方法
　　材料 真核表达载体pEGFPC1、 pEGFPC1/HPV18 E2由法国巴斯德研究所Francoise Thierry教授惠赠;　JM109由本室保存; 人单核细胞白血病THP1细胞购自中国典型培养物保存中心; 低温高速离心机是HETTICH公司产品; 倒置荧光显微镜是日本Nikon公司产品; 全自动酶标仪是芬兰雷勃公司产品; 限制性核酸内切酶、 T4 DNA连接酶、 佛波脂购于深圳晶美生物公司; SofastTM转染试剂购于夏门太阳马生物有限公司; 兔抗GFP抗体购于eBioscience公司; HRP标记羊抗兔IgG购自Solarbio公司; TNFα和IL1β定量检测试验盒购于上海森雄科技实业有限公司。
　　方法
　　pEGFPC1/TAD、 pEGFPC1/DBD重组载体的构建 分别设计上、 下游含限制性核酸内切酶EcoR I、 BamH I酶切位点的2对引物。P1: 5′GTAGAATTCCATGGAGACACCGAAGGAAAC3′和P2: 5′CCCGGATCCACTGCACATAGAGTCATTAC3′; P3: 5′GCGAATTCCACTACGCCTATAATAC3′和P4: 5′GCCGGATCCTTACATTGTCATGTATC3′。以pEGFPC1/E2为, 通过PCR分别扩增出TAD、 DBD基因片段。以EcoR I、 BamH I双酶切TAD、 DBD及空载体pEGFPC1, 用T4 DNA酶过夜连接, 转化 JM109并提取质粒, 酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
　　重组质粒在MΦ中的表达与定位 悬浮细胞THP1在体外培养经佛波脂活化后可分化为贴壁的MΦ。转染前3 d, THP1细胞用按×109细胞/L转入24孔板, 每孔1 mL, 培养24 h后加入终浓度为40 μg/L的PMA诱导48 h。用新鲜培养基洗涤细胞后每孔分别加入3种重组质粒及pEGFPC1各 μg, 同时作空白对照, 用SofastTM转染试剂按说明书转染细胞。细胞转染后6 h, 用新鲜培养基洗涤2次, 每孔加1 mL培养基继续培养。用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达与定位, 在表达荧光细胞数量最多时收集细胞, 置4℃下加入50 μL细胞裂解液30 min, 10000 r/min4℃离心5 min, 收获细胞裂解上清液经SDSPAGE后, 以抗GFP抗体为一抗作Western blot鉴定。
　　重组质粒高表达对MΦ凋亡及其分泌活性影响的测定 按上述方法转染细胞, 每组设6个复孔, 然后于表达荧光细胞数量最多时取培养液100 μL, 用TNFα和IL1β定量ELISA试剂盒按说明分别测定A492值, 求出TNFα和IL1β含量(ng/L)。同时取每组前3孔细胞作Giemsa染色, 显微镜下观察各组MΦ的形态变化, 并收集后3孔MΦ于 mL EP管中, 加入1 mL700 mL/L乙醇4℃过夜后由中国中医药研究院基础所经FCM测定细胞凋亡率。结果用学作多个样本均数的多重比较分析。
　　2 结果
　　重组质粒的鉴定 双酶切重组质粒琼脂糖电泳结果见1。经测序证明重组质粒分别含有618 bp、 243 bp的目的基因片段, 无碱基错配和移码突变, 且分别与HPV18 E2 TAD和DBD读码框完全一致。
　　图1 pEGFPC1/DBD重组质粒的鉴定
　　Fig 1 Enzymatic digestion of pEGFPC1/TAD and pEGFPC1/DBD recombinant
　　1: 100 bp DNA marker; 2: pEGFP-C1/TAD cut with BamH I and EcoR I; 3: TAD DNA fragment; 4: pEGFPC1/DBD cut with BamH I and EcoR I; 5: DBD DNA fragment; 6: pEGFPC1 cut with BamH I and EcoR I; 7: DNA marker DL 15000.
　　重组质粒在细胞中的表达与定位 经倒置荧光显微镜观察, 重组质粒的表达定位如图2, GFPDBD融合蛋白完全表达定位于细胞核内, GFPTAD完全表达定位于细胞质, GFPE2、 GFP在细胞核、 细胞质内均有表达, 但GFPE2表达组细胞核荧光亮度强于细胞胞质, GFP在细胞核质内呈均匀表达。转染48 h后发荧光细胞数量最多, 收集此时的细胞裂解, Western blot结果, 图3中相对分子质量(Mr)约29400、 53400、 70700、 38600的条带分别与预期GFP、 GFPTAD、 GFPE2、 GFPDBD大小一致。
　　图2 重组质粒在细胞中表达的荧光显微照片
　　Fig 2 Fluorescent microscopical photos of cells expressing(×400)
　　图3 重组质粒在MΦ表达产物的Western blot分析
　　Fig 3 Western blot result of macrophages transfected by one kind of recombinant plasmids
　　1: Macrophages lysate; 2: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1; 3: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1/TAD; 4: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1/E2; 5: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1/DBD.
　重组质粒高表达对MΦ分泌活性的影响 于48 h测各组培养液中TNFα和IL1β含量, 将每组6个数据经分析, 结果显示: GFPE2、 GFPTAD表达组2种细胞因子含量均明显升高, 与对照组比较有统计学意义()。GFPE2与GFPTAD之间TNFα浓度也有统计学意义, GFPTAD表达组TNFα浓度大于GFPE2表达组; IL1β浓度无统计学意义。GFPDBD、 GFP瞬时高表达对2种细胞因子的分泌均无统计学意义。
　　图4 细胞培养基上清中TNFα和IL1β的浓度
　　Fig 4 The level of TNFα or IL1β in the cell culture medium
　　重组质粒高表达对MΦ凋亡的影响 于48 h后取各细胞作Giemsa染色, 镜下观察如图5所示: 对照组和GFP、 GFPDBD表达组大部分MΦ中等大小, 单个散在, 梭形或多角形, 折光性好, 呈正常细胞形态。GFPTAD、 GFPE2表达组部分MΦ体积变小、 变圆, 细胞聚集, 胞质浓缩, 核浓染, 部分细胞溶解、 核碎裂, 呈现凋亡细胞形态。
　　FCM检测各组细胞凋亡率, 将每组3个数据经软件统计分析, 结果: GFPE2、 GFPTAD表达组(n=3)MΦ凋亡率明显升高, 与对照组(n=3)比较有统计学意义[(±)% vs (±)%、 (±)% vs (±)%, ]。GFPE2与GFPTAD之间MΦ凋亡率有统计学意义[(±)% vs ±)%, ]。GFPDBD、 GFP瞬时高表达组MΦ凋亡率与对照组比较无统计学意义[(±)% vs (±)%、 (±)% vs (±)%]。
　　图5 Giemsa染色的各组MΦ
　　Fig 5 The Giemsa stain of macrophages in different groups(×400)
　　3 讨论

　　在与HPV18 相关的宫颈癌中, 常发现其DNA整合于宫颈癌细胞基因组, 但在该整合过程中, 通常存在E2基因的缺失, 缺少E2蛋白的表达是HPV18所致宫颈癌的一个重要标志。而且, 在HPV18感染的宫颈癌细胞中, 重新引入E2基因可以抑制HPV致癌基因E6、 E7的表达, 使细胞周阻滞止于G1期, 细胞发生衰老或凋亡。这些结果表明, HPV18 E2蛋白在癌变过程中可能发生负调控的作用。
　　MΦ是重要免疫细胞, 具有较强吞噬和杀伤能力, 可调控局部细胞微及抑制肿瘤, 并能提呈抗原和产生TNFα、 IL1β等细胞因子, 参与机体特异性免疫应答。本研究中我们将HPV18 E2及其TAD、 DBD与EGFP融合蛋白载体在MΦ中瞬时高表达发现, GFPDBD融合蛋白完全表达于细胞核内, GFPTAD完全表达于细胞质, GFPE2、 GFP在细胞核、 质内均有表达, 但GFPE2主要表达于细胞核内。该现象与Blachon等的研究结果相一致, HPV18 E2蛋白N端结构域含有一段核输出序列, C端结构域含有一段核定位序列。同时, 我们发现GFPE2、 GFPTAD瞬时高表达, 可上调MΦ分泌TNFα和IL1β, 并诱导MΦ凋亡, 且除IL1β外, GFPTAD的作用均强于GFPE2, 原因可能是由于在细胞内定位的不同导致其作用的差异。而GFPDBD、 GFP瞬时高表对MΦ的分泌和凋亡均无显着性影响, 这表明在无HPV感染的MΦ中, 起作用的是E2蛋白N端结构域。TNFα与肿瘤细胞凋亡密切相关, 当MΦ分泌TNFα的量显着升高时, 也有可能影响MΦ的凋亡率。适量的TNFα介导的免疫反应对机体具有保护作用, 它可抑制病毒复制, 选择性破坏病毒感染细胞, 但过量的TNFα则会引起机体的损伤。在宫颈上皮内瘤变前期E2蛋白高表达, 而后期病变和高度恶性的宫颈癌中, 存在E2蛋白去表达及E6、 E7癌蛋白的高表达的现象, 本实验中我们发现GFPE2、 GFPTAD在体外培养的MΦ中瞬时高表达上调其TNFα和IL1β分泌水平, 因此我们推测E2蛋白对HPV感染者体内细胞因子水平的改变以及免疫应答方面起重要作用, 但HPV18 E2蛋白上调MΦ分泌TNFα对机体起何种作用及其机制目前尚不清楚, 有待进一步研究。
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