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人体骨髓基质干细胞冷冻干燥的探索性实验

　　摘要　　人体骨髓基质干细胞已成为组织工程、细胞移植和基因治疗等领域的重要研究对象,目前对它已有低温保存的研究,而通过冷冻干燥的方法对其进行保存国内外未见报导。实验尝试用冻干的方法来保存骨髓基质干细胞。文中选取海藻糖、ＰＶＰ、ＨＥＳ等作保护剂,应用差示扫描量热仪(ＤＳＣ)测量其结晶温度和玻璃化转变温度;随后对加入保护剂的细胞溶液进行冻干实验,并应用流式细胞仪对冻干样品复水后的细胞活性进行了测定,其中30%ＰＶＰ+20%海藻糖对细胞的保护效果较好,细胞成活率达到%。
关键词热工学 冷冻干燥 人体骨髓基质干细胞 冻干保护剂
　　1　前言
　　骨髓中含有两类组织成份:造血干细胞及其分化的子代细胞,和结缔组织(被称为基质)。在基质中除了存在着无成骨性的脂质细胞、网状细胞、内皮细胞和成纤维细胞外,还有一种独立的细胞系———基质干细胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ)。它是一种成纤维细胞样的梭型贴壁细胞,与造血干细胞一样具有多分化潜能,因而日益受到人们的关注。在特定的条件下,骨髓基质干细胞可以分化形成成骨细胞(ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ)、软骨细胞(ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ)、成肌细胞(ｍｙｏｂｌａｓｔｓ)和神经细胞(ｎｅｕｒｏｃｙｔｅｓ)[]。ＭＳＣｓ易于获得、特性稳定,是组织工程中理想的种子细胞,有很好的应用前景。它的广泛应用使其保存问题备受关注。目前,多采用-196℃的深低温保存,但液氮费和管理费用相当昂贵,所以有必要探索新的保存方法。
　　冷冻干燥技术是在低温真空下干燥制品,干燥后体积、形状基本不变,物质呈海绵状,无干缩;复水时能够迅速还原成原来的性状;能够除去物质中90%以上的水分,制品的保存期长,而且在保存过程中可以置于室温下保存;且便于长途运输。由于以上这些无可比拟的优越性,冻干保存倍受人们的关注,但由于活体细胞结构的复杂性,对其冻干保存一直是尚未解决的难题,仍然处于探索阶段[4～6]。对人体骨髓基质干细胞进行冻干实验研究,选取了几种保护剂,并应用差示扫描量热仪(ＤＳＣ)对加入不同保护剂的细胞悬液的结晶温度以及其最大浓缩玻璃化转变温度进行了测定;随后对样品进行冷冻干燥实验;并应用流式细胞仪对冻干结果进行了活性检测。
　　2　保护剂的选取与配制
　　保护剂的选取
　　在许多生物制品的冷冻干燥过程中,常常采用低聚糖,尤其是二糖作为保护剂。这是因为二糖既能在冻结过程中起到低温保护剂的功能,又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。在生物制品的冷冻干燥配方中,海藻糖较常用,它具有较好的保护能力,对于海藻糖的保护机理,Ｃｒｏｗｅ等认为:(1)海藻糖的水合分子半径要比其它糖(如蔗糖、葡糖糖)大倍,这使得它的水合分子独立于被保护的蛋白质的水合分子之外,从而起到稳定蛋白质、保护细胞膜和细胞内重要的膜结构的作用;(2)海藻糖能够降低干态膜脂的熔点,从而避免了在复水过程中膜的相变;(3)海藻糖能够形成稳定的二水化合物。在有少量水分存在时,这些二水化合物能防止水分与未水合的海藻糖结合,从而保持较高的玻璃化温度。这样冻干后的样品即便在较为潮湿的环境中也可保存较长时间。
　　由于多元醇与糖的官能团都是羟基,通常认为多元醇在生物制品的冷冻干燥过程能起到保护作用。另外,聚合物能够提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度等有利因素,因而在有些生物制品的配方中常常含有各种聚合物类保护剂。所以本文选用海藻糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮(ＰＶＰ)、羟乙基淀粉(ＨＥＳ)和牛血清(ＦＢＳ)等作为保护剂。
　　保护剂的配制
　　实验中所采用的人体骨髓基质干细胞由上海市组织工程研究与开发中心提供。
　　选用的几种实验材料如下:
　　聚乙烯吡咯烷酮Ｋ30(ＰＶＰＫ30,上海);甘露醇(上海);6%羟乙基淀粉注射液(ＨＥＳ,北京);海藻糖(上海);小牛血清(ＦｅｔａｌＢｏｒｉｎｅＳｅｒｕｍ,美国)。
　　首先配制不同浓度的组分:ＰＶＰ(30%,40%,50%Ｗ/Ｗ);海藻糖(20%Ｗ/Ｗ);甘露醇(10%Ｗ/Ｗ),然后将各组分按照一定的配比滴注到细胞悬液中,同时振荡摇匀,配制成的细胞溶液具体如下表(Ａ为单纯的细胞悬液):　　
　　3　应用ＤＳＣ测量保护剂参数
　　为了防止在冻干过程中受损伤,我们一般希望将样品冷却到玻璃化转变温度(Ｔｇ)之下,并在此温度下进行干燥。还有另外一个重要参数,即最大冻结浓缩玻璃化转变温度(Ｔｇ’),它也是冷冻干燥中需要了解的最重要的参数,对于制定冷冻干燥工艺和产品质量的预测具有重要意义[8,9],而ＤＳＣ则是研究物质玻璃化转变的最现代的设备。
　　实验中使用的ＤＳＣ(ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ,差示扫描量热仪)是ＤＳＣ-ＰｙｒｉｓＤｉａｍｏｎｄ(美国Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ公司)。其基本思想是在样品和参比始终保持相同温度的条件下,测定为满足此条件样品和参比两端所需的能量差,并直接作为信号△Ｑ(热量差)输出。ＤＳＣ的热流曲线记录的是输入到样品和参比的功率差。这个设备的冷却方式为液氮冷却,样品冲洗气体为高纯度氦气(纯度%),流量为25ｍｌ/ｍｉｎ。为避免炉块结霜,加样时用高纯度氮气冲洗炉块。样品皿为标准液体铝皿,用液固通用压机(美国Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ公司)压制。样品皿使用前,用无水乙醇浸泡以除去表面可能存在的污物,然后用纯水清洗并烘干后备用。在降温相变过程中采用Ｓ型基线,以消除基线误差。
　　实验分别测量了Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ七种溶液的结晶温度和玻璃化转变温度:将压制好的细胞溶液样品以20℃/ｍｉｎ从10℃降温到-60℃;并保持30ｓｅｃ;然后再以20℃/ｍｉｎ从-60℃升温到10℃。得出各样品的降温与升温ＤＳＣ全过程热流曲线和玻璃化段的热流曲线,选取部分示于图1-4:　　　　
　　将实测的结果列于表2:　　
　　由表2可得:在实验条件下,单纯的细胞悬液Ａ的结晶温度为-℃,它没有明显的玻璃化转变。而在Ａ中加入1份20%的海藻糖,以及浓度分别为30%、40%和50%的两份ＰＶＰ后(Ｂ,Ｃ,Ｄ),可以较明显的看出玻璃化转变。样品Ｂ,Ｃ,Ｄ的结晶温度分别为-℃、-℃和-℃,但玻璃化转变温度Ｔｇ’却没有发生较大的变化;Ｅ没有明显的玻璃化转变;Ｆ(在Ｅ中加入甘露醇)出现玻璃化转变,可见甘露醇有利于玻璃化的形成;Ｇ(在Ｆ中加入小牛血清)也出现玻璃化转变,与Ｆ相比,结晶温度升高,而Ｔｇ’变化不大,均为-35℃左右。由上表可以看出,不同浓度的ＰＶＰ溶液的玻璃化转变温度要高于ＨＥＳ溶液的玻璃化转变温度,即ＰＶＰ形成玻璃的能力要强于ＨＥＳ。
　　4　冻干实验实验
　　应用美国Ａｄｖａｎｔａｇｅ冷冻干燥机对细胞溶液进行冷冻干燥。另外,为了采集冻干过程中的温度,在此系统上加装了实测物料、冷阱和隔板温度的热电偶温度计,以及温度数据自动采集记录装置。但由于该冻干机的控制面板尚存在问题,无法精确控制干燥温度,因此干燥过程中隔板的温度过高。
　　冷冻干燥可分为预冻结和升华干燥与解析干燥三个过程,在预冻结过程应该使细胞溶液的温度低于结晶温度和玻璃化转变温度,所以在试验中将其冻结到-40℃,时间为ｈ。随后对样品进行干燥,整个冻干过程持续时间为44小时,此过程中各点温度的变化情况,即冻干曲线,示于图5:　　
　　5　冻干细胞活性的测定
　　细胞的活性可以通过测定细胞碘化丙锭ＰＩ(ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｃｌｅｓｔｕｉｎｉｎｙ)拒染率来确定。ＰＩ染色是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变,通过各种染色体荧光染料对凋亡细胞ＤＮＡ可染性发生的改变及凋亡细胞形态上的改变影响细胞的光散色特性等原理检测细胞凋亡和存活率。
　　实验应用流式细胞仪(中科院上海细胞所)对冻干样品分别进行了ＰＩ染色活性鉴定。
　　图6和图7分别为样品Ｂ、Ｇ的活性检测结果。检测数据以直方图的形式表达其中Ｘ轴为测量强度,Ｙ轴为细胞数目。上面的方格为ＵＬ,表示被染色的细胞;下面的方格为ＬＬ,表示未被染色的细胞。Ｅｖｅｎｔ为所测细胞数,Ｇａｔｅｄ为其所占比率。
　　总结各样品的活性检测结果,示于表4:　　　　　　
　　由各样品的流式细胞仪的ＰＩ检测结果可知,样品Ｂ(30%ＰＶＰ+20%海藻糖+细胞悬液)冻干后骨髓基质干细胞的存活率最高,为%。而随着ＰＶＰ浓度的升高,如样品Ｃ(40%ＰＶＰ+20%海藻糖+细胞悬液)、Ｄ(50%ＰＶＰ+20%海藻糖+细胞悬液),细胞存活率逐渐降低。同时从表中可分析出ＰＶＰ对细胞的保护效果要优于ＨＥＳ,且加入甘露醇和小牛血清均可提高细胞的存活率。将细胞存活率与各样品的玻璃化转变温度相联系,可以看出没有玻璃化转变温度的样品Ｅ(6%ＨＥＳ+20%海藻糖+细胞悬液)冻干后细胞的存活率很低。而Ｂ、Ｃ、Ｄ的玻璃化转变温度相对Ｆ、Ｇ较高,同时对应的细胞存活率也较高。可见,玻璃化转变温度与冻干的结果是相关的。
　　6　结论
　　通过冷冻干燥的方法对骨髓基质干细胞进行保存至今未见报导。实验尝试对人体骨髓基质干细胞进行冷冻干燥。选取海藻糖、ＰＶＰ、ＨＥＳ等作保护剂,应用差示扫描量热仪(ＤＳＣ)测量其结晶温度Ｔｅ和玻璃化转变温度Ｔｇ’,对冻干进行探索性研究,其中保护剂的组成、浓度、玻璃化转变温度以及冻干过程各因素都对细胞的存活率有影响。在实验条件下,30%ＰＶＰ+20%海藻糖对细胞的保护效果较好,细胞成活率达到%,表明探索骨髓基质干细胞的冷冻干燥是有希望的。由于实验所用的冻干机仍然不能精确控制干燥温度,在干燥过程中隔板的温度过高,细胞存活率还不够理想,有望在改进实验设备后得到提高。
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