免疫组化.pptx

免疫组化技术免疫组化技术 杨林杨林 高云娟高云娟 药理学专业药理学专业 基本原理基本原理 通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原形成抗原 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。一、组织与细胞材料的制一、组织与细胞材料的制 备备 细胞：细胞涂片和细胞爬片细胞：细胞涂片和细胞爬片组织：石蜡切片和冰冻切片组织：石蜡切片和冰冻切片组织切片的制作组织切片的制作 1 1、组织的固定、组织的固定2 2、组织石蜡包埋组织石蜡包埋 3 3、切片、切片组织切片机组织切片机固定的目的固定的目的:（1 1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。织细胞的固有形态。（2 2）使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。以保持它原有的结构与生活时相仿。（3 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。于制片。（5 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 （6 6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。便于辨认。固定液的选择固定液的选择 固定的时间固定的时间 通常所用的固定液：通常所用的固定液：1 1、甲醛固定液（、甲醛固定液（10101010福尔马林，福尔马林，福尔马林，福尔马林，10101010中性福尔马林，中性福尔马林，中性福尔马林，中性福尔马林，10101010中性缓冲福尔马林）中性缓冲福尔马林）中性缓冲福尔马林）中性缓冲福尔马林）2 2 2 2、PLPPLPPLPPLP固定液：过碘酸固定液：过碘酸固定液：过碘酸固定液：过碘酸-赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固多聚甲醛固定液。该固多聚甲醛固定液。该固多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保原性保原性保原性保 存较好。存较好。存较好。存较好。3 3 3 3、MethacarnMethacarnMethacarnMethacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定时间的长短要根据组织块的厚度，固定液的种类固定时间的长短要根据组织块的厚度，固定液的种类以及浓度，温度而定，一般而言，厚度越后，固定时间越长以及浓度，温度而定，一般而言，厚度越后，固定时间越长组织石蜡包埋组织石蜡包埋 组织：组织：组织：组织：75757575乙醇乙醇乙醇乙醇30303030120min120min120min120min，85858585乙醇乙醇乙醇乙醇30303030120120120120minminminmin，95959595醇醇醇醇 2h 2h 2h 2h，95959595乙醇乙醇乙醇乙醇 2h 2h 2h 2h，95959595乙醇乙醇乙醇乙醇过夜，过夜，过夜，过夜，无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇30 30 30 30 60min60min60min60min，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇，无水乙醇3030303060min60min60min60min，无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇60min60min60min60min120min120min120min120min，二甲苯，二甲苯，二甲苯，二甲苯、和和和和各各各各15min15min15min15min（可视观察结果而定），石蜡（可视观察结果而定），石蜡（可视观察结果而定），石蜡（可视观察结果而定），石蜡30min30min30min30min石蜡石蜡石蜡石蜡1 1 1 12h2h2h2h，石蜡，石蜡，石蜡，石蜡22223h3h3h3h。切切 片片 石蜡切片：石蜡切片：石蜡切片：石蜡切片：1 1 1 1、连续切片按序贴在玻片的下、连续切片按序贴在玻片的下、连续切片按序贴在玻片的下、连续切片按序贴在玻片的下1/31/31/31/3。2 2 2 2、5252525260606060烤片烤片烤片烤片18h18h18h18h。3 3 3 3、切片厚、切片厚、切片厚、切片厚2 2 2 24m4m4m4m。4 4 4 4、切片可在、切片可在、切片可在、切片可在4444保存数年保存数年保存数年保存数年冰冻切片：冰冻切片：冰冻切片：冰冻切片：(1)(1)(1)(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需 经庶糖处理经庶糖处理经庶糖处理经庶糖处理24h24h24h24h，冰冻切片。，冰冻切片。，冰冻切片。，冰冻切片。(2)(2)(2)(2)冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定 (3)(3)(3)(3)冰冻切片固定后冰冻切片固定后冰冻切片固定后冰冻切片固定后-80-80-80-80保存备用保存备用保存备用保存备用1 1 1 1、将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶、将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶、将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶、将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。或六孔板内。或六孔板内。或六孔板内。2 2 2 2、待细胞生长达到、待细胞生长达到、待细胞生长达到、待细胞生长达到60606060以上后取以上后取以上后取以上后取出玻片。出玻片。出玻片。出玻片。3 3 3 3、用、用、用、用4%4%4%4%的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定2h2h2h2h以上。以上。以上。以上。4 4 4 4、可加甘油封存置于零下、可加甘油封存置于零下、可加甘油封存置于零下、可加甘油封存置于零下20202020度度度度保存。保存。保存。保存。细胞爬片细胞爬片 细胞培养六孔板细胞培养六孔板细胞涂片细胞涂片 1 1 1 1、离心将细胞收集出来，用预冷的、离心将细胞收集出来，用预冷的、离心将细胞收集出来，用预冷的、离心将细胞收集出来，用预冷的PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗2 2 2 23 3 3 3遍，遍，遍，遍，最后用最后用最后用最后用PBSPBSPBSPBS将细胞重悬。将细胞重悬。将细胞重悬。将细胞重悬。2 2 2 2、吸取、吸取、吸取、吸取3030303050ul50ul50ul50ul（可根据细胞量调整）（可根据细胞量调整）（可根据细胞量调整）（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。3 3 3 3、待稍微风干以后加、待稍微风干以后加、待稍微风干以后加、待稍微风干以后加4 4 4 4多聚甲醛溶多聚甲醛溶多聚甲醛溶多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定液覆盖细胞，固定液覆盖细胞，固定液覆盖细胞，固定2 2 2 24 4 4 4小时。小时。小时。小时。4 4 4 4、在细胞上加一层甘油放、在细胞上加一层甘油放、在细胞上加一层甘油放、在细胞上加一层甘油放-20-20-20-20保存保存保存保存二、免疫组化二、免疫组化 被检测物质被检测物质 组织或者是细胞中凡是能作为抗原或是组织或者是细胞中凡是能作为抗原或是半抗原的物质，如如蛋白质、多糖、磷脂半抗原的物质，如如蛋白质、多糖、磷脂、受体、酶、核酸及病原体等都可用、受体、酶、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。相应的特异性抗体进行检测。所用抗体所用抗体 一般为单克隆抗体或者是多克隆抗体一般为单克隆抗体或者是多克隆抗体被检测抗原的修复被检测抗原的修复 指石蜡，冰冻，火棉胶，塑料切片免疫组织化学指石蜡，冰冻，火棉胶，塑料切片免疫组织化学前用胰蛋白酶，尿素，表面活性剂等通过机械的方式前用胰蛋白酶，尿素，表面活性剂等通过机械的方式断开福尔马林固定导致的抗原表位和不相关的蛋白的断开福尔马林固定导致的抗原表位和不相关的蛋白的交联键，从而使得掩盖的抗原决定簇或者变性的抗原交联键，从而使得掩盖的抗原决定簇或者变性的抗原重新暴露，使抗体更好的渗透，与表位相结合。重新暴露，使抗体更好的渗透，与表位相结合。抗原修复的方法抗原修复的方法加热修复加热修复非加热修复非加热修复微波抗原修复法微波抗原修复法高压锅抗原修复法高压锅抗原修复法水浴高湿抗原修复法水浴高湿抗原修复法酶消化法酶消化法酸水解法酸水解法真空负压法真空负压法 等。等。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。目的是破坏细胞内分钟。目的是破坏细胞内分钟。目的是破坏细胞内分钟。目的是破坏细胞内的过氧化氢酶的过氧化氢酶的过氧化氢酶的过氧化氢酶自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次次，1 1 1 1分钟分钟分钟分钟/次。次。次。次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20202020分钟分钟分钟分钟左右。左右。左右。左右。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，2 2 2 2分钟分钟分钟分钟/次。次。次。次。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法免疫组化免疫组化 按照标记物质的种类：免疫荧光法，按照标记物质的种类：免疫荧光法，放射免疫法，免疫酶标法放射免疫法，免疫酶标法按照染色步骤：直接法和间接法，按照染色步骤：直接法和间接法，间接法较直接法灵敏度高间接法较直接法灵敏度高按结合方式：抗原按结合方式：抗原-抗体结合抗体结合 如如PAPPAP法法 ，亲和连接法亲和连接法-ABC-ABC法和法和SPSP法等，聚合法等，聚合 物连接法适合于内源性生物素含量物连接法适合于内源性生物素含量 高的组织抗原检测高的组织抗原检测 直接法直接法 间接法间接法荧光标记免疫组化荧光标记免疫组化 二步法免疫组化染色步骤二步法免疫组化染色步骤 1 1 1 1、二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯。、二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯。、二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯。、二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯。2 2 2 2、PBSPBSPBSPBS冲洗冲洗冲洗冲洗3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次3 3 3 3分钟。分钟。分钟。分钟。3 3 3 3、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复相应的修复相应的修复相应的修复 。4 4 4 4、0.3%0.3%0.3%0.3%过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断20202020分钟，以消除分钟，以消除分钟，以消除分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。内源性过氧化物酶的活性。内源性过氧化物酶的活性。内源性过氧化物酶的活性。5 5 5 5、PBSPBSPBSPBS冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次。次。次。次。6 6 6 6、正常山羊血清室温封闭、正常山羊血清室温封闭、正常山羊血清室温封闭、正常山羊血清室温封闭10101010分钟。分钟。分钟。分钟。7 7 7 7、甩去血清，加入适当稀释的一抗，、甩去血清，加入适当稀释的一抗，、甩去血清，加入适当稀释的一抗，、甩去血清，加入适当稀释的一抗，37373737孵育孵育孵育孵育60606060分钟或分钟或分钟或分钟或4444过夜过夜过夜过夜8 8 8 8、PBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次9 9 9 9、滴加多聚螯合物，、滴加多聚螯合物，、滴加多聚螯合物，、滴加多聚螯合物，37373737孵育孵育孵育孵育30303030分钟分钟分钟分钟PBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次10101010、新鲜配置酶底物显色液、新鲜配置酶底物显色液、新鲜配置酶底物显色液、新鲜配置酶底物显色液DABDABDABDAB显色显色显色显色3 3 3 310101010分钟分钟分钟分钟流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗11111111、苏木素复染，脱水，透明，封片。、苏木素复染，脱水，透明，封片。、苏木素复染，脱水，透明，封片。、苏木素复染，脱水，透明，封片。12121212、显微镜观察拍照、显微镜观察拍照、显微镜观察拍照、显微镜观察拍照13131313、IPPIPPIPPIPP软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度注意事项注意事项 一、一、抗体的保存抗体的保存 1 1 1 1、浓缩抗体：有效期内，只需放在、浓缩抗体：有效期内，只需放在、浓缩抗体：有效期内，只需放在、浓缩抗体：有效期内，只需放在4 4 4 4 冰箱内，冰箱内，冰箱内，冰箱内，保存时间可达保存时间可达保存时间可达保存时间可达1-31-31-31-3年。年。年。年。2 2 2 2、即用型抗体：理论上在、即用型抗体：理论上在、即用型抗体：理论上在、即用型抗体：理论上在4 4 4 4 冰箱内冰箱内冰箱内冰箱内 可保存可保存可保存可保存半年左右。半年左右。半年左右。半年左右。3 3 3 3、PBSPBSPBSPBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置置置置1-1-1-1-2 2 2 2个月。个月。个月。个月。二、出现假阳性的原因二、出现假阳性的原因 1 1、组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边、组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。2 2、出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏、出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。3 3、抗体的交叉反应。、抗体的交叉反应。Thank you!Thank you!Charles Charles CandiceCandice