免疫血清制备.pptx

免疫血清制备中山医学院免疫学教研室实验目的和要求n了解影响机体免疫应答强度的了解影响机体免疫应答强度的因素因素;n明确初次应答和再次应答抗体产生的明确初次应答和再次应答抗体产生的规律规律；n制备牛血清白蛋白（制备牛血清白蛋白（BSABSA）的抗血清；）的抗血清；n熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法；熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法；n了解抗体检测的常用方法。了解抗体检测的常用方法。在免疫学实验中在免疫学实验中,为制备抗体通常以为制备抗体通常以抗原性物质给动物注射抗原性物质给动物注射,经一定时间经一定时间后后,动物血清中可产生大量特异性抗动物血清中可产生大量特异性抗体，这种含有特异性抗体的血清称体，这种含有特异性抗体的血清称免免疫血清疫血清。实验原理免疫应答的影响因素 抗体的产生通常与抗体的产生通常与抗原的质和量抗原的质和量、动物种类动物种类以及以及接种的途径接种的途径有密有密切关系。切关系。一、抗原分子的结构和性质一、抗原分子的结构和性质 1.1.分子量：分子量越大，免疫原性越强。分子量：分子量越大，免疫原性越强。2.2.化学组成及结构化学组成及结构 （1 1）蛋白质）蛋白质 （2 2）多糖：具有免疫原性）多糖：具有免疫原性,较蛋白质弱。较蛋白质弱。（3 3）核酸：多无免疫原性。）核酸：多无免疫原性。3.3.结构结构的复杂性的复杂性 4.4.分子构象分子构象 5.5.易接近性易接近性 6.6.物理状态物理状态二、宿主方面的因素二、宿主方面的因素 1.1.遗传因素遗传因素 同种动物不同品系及不同个体对同同种动物不同品系及不同个体对同种抗原产生不同强度的免疫应答。种抗原产生不同强度的免疫应答。2.2.其他因素其他因素 年龄、性别与健康状态。年龄、性别与健康状态。三、免疫原的剂量及进入途径三、免疫原的剂量及进入途径 （1 1）剂量）剂量 1 1）剂量不足或过多均不引起免疫应答。）剂量不足或过多均不引起免疫应答。2 2）重复进入引起强免疫应答。）重复进入引起强免疫应答。（2 2）途径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、呼）途径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、呼吸道和口服免疫应答水平依次降低。吸道和口服免疫应答水平依次降低。抗体产生的一般规律n初次应答和再次应答规律。抗体产生的顺序规律：抗体产生的顺序规律：IgM -IgG -IgA -IgD -IgE IgM -IgG -IgA -IgD -IgE 初次应答和再次应答抗体产生比较实验方案l免疫佐剂制备及动物初次免疫（第一周）l再次免疫及血清采集（第二周）l血清采集及抗体检测（第三周）W1W2W3未免疫血清采集再次免疫血清采集初次免疫血清采集初次免疫再次免疫实验材料n动物：昆明鼠（每组一只），约20g只。n抗原：4mgml牛血清白蛋白（BSA)n佐剂：完全福氏佐剂。n其它：PBS、1ml塑料管（保存血清用），无菌小试管，棉签，1ml注射器、12针头等。实验流程12只小鼠小鼠眼眶取血制备血清2 2只只2只只8只只W1W3W2初次免疫（1只/组）再次 免疫1.5mlBSA1.5ml完全福氏佐剂搅拌完全乳化第一周实验步骤 1.抗原制备滴于水中经久不散 2.动物免疫n用1ml注射器1212针头吸出完全乳化的抗原1ml；n换4 4针头双后足垫和背部皮下接种，每处约10-20ul。(接种处先用碘酒、酒精消毒)n将免疫后的小鼠放回鼠笼。n1ml注射器（内有乳化好的抗原）贴好标签，4保存下次用。第一周实验步骤 3.采集阴性血清（每班2只）n用无菌小试管收集未免疫小鼠血（眼眶放血法），标记后送准备室；n2,000 rpm离心 10分钟;n吸取血清置1ml塑料管，做好标记;注意:老鼠断颈椎处死后放到楼梯口的红桶第一周实验步骤第二次课内容抗原抗体反应抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物合物。物质基础物质基础:1 1）抗原表位与抗体高变区间的互补结合）抗原表位与抗体高变区间的互补结合 2 2）抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表）抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表 面的结合面的结合 3 3）抗原抗体之间的结合力）抗原抗体之间的结合力 4 4）亲水胶体转化为疏水胶体）亲水胶体转化为疏水胶体抗原抗体结合力抗原抗体结合力静电引力静电引力（electrostatic forces）范德华引力范德华引力:作用最小作用最小（van der Waals interactions）氢键氢键:最具特异性最具特异性 （hydrogen bond）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大（hydrophobic interactions）抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力示意图抗原抗体的亲和力和亲合力抗原抗体的亲和力和亲合力n亲和力：抗体分子上一个抗原结合点与亲和力：抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力的引力，是抗原抗体间固有的结合力n亲合力：抗体结合部位与抗原表位之间亲合力：抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度结合的强度亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体n抗原抗体的结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。如再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。抗原抗原(亲水胶体亲水胶体)抗体抗体(亲水胶体亲水胶体)抗原抗体复合物抗原抗体复合物 (疏水胶体疏水胶体)电解质电解质可见反应可见反应 +抗原抗体反应的一般规律n特异性与交叉反应性；n可逆性：表面的结合，有可逆性；抗原抗体交叉反应示意图抗原抗体交叉反应示意图n适比性：适合的比例，反应才可见；n阶段性：不可见 可见反应；n条件依赖性：PH，温度，电解质。抗原抗体反应比例性示意图抗原抗体反应比例性示意图u血清制备：取首次免疫后的小鼠2只，采集血清(方法同上),标记后冻存备用。u再次免疫：其余小鼠于腹腔和背部皮下注射上次制备的乳化抗原，每鼠注射0.5ml。第二周实验步骤第三周实验步骤 血清制备：u采集剩余小鼠血,将血置室温半小时凝固;u2,000 rpm离心10分钟;u吸取血清置1ml塑料管，做好标记.血清抗体检测：以ELISA测定抗体效价，以未免疫鼠血清作对照。Thanks!