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DNA含量及S期细胞比值与肺癌生物学特性的关系

　　【关键词】 肺癌；流式细胞仪；DNA含量；生物学特征
　　摘要：目的 研究流式细胞术DNA含量及S期细胞比值(SPF)测定及其与肺癌临床病理指标的关系。方法 应用流式细胞仪(FCM)对56例肺癌新鲜组织及36例非癌性病变的肺新鲜组织的DNA含量(DI)和SPF进行测定，并结合临床病理资料分析其意义。结果 ①肺癌病变组织DNA含量、SPF均显着高于非癌性病变组织()。肺癌组异倍体率%，而肺非癌性病变组异倍体率%，两组相比差异有显着性()；②肺癌组织DNA含量与肺癌组织学类型和临床分期无明显关系()；③肺癌异倍体组SPF高于二倍体组()肺癌SPF与肿瘤分期、转移呈正相关关系()；随临床分期增加，SPF均相应增加()。结论 DNA含量改变、增殖活性的增加在肺癌组织中具有普遍意义。肺癌组织增殖活性越高，肿瘤转移的潜能越大。肺癌组织的FCM DNA含量及细胞增殖活性测定有助于进一步研究肺癌的生物学行为。
　　关键词：肺癌；流式细胞仪；DNA含量；生物学特征
　　Relation of FCM DNA content and Sphase fraction to the biological characteristics of lung cancer
　　ABSTRACT: Objective To investigate the relation of DNA content and SPF to the clinicopathological characteristic in lung cancer. Methods Fresh specimens taken from 56 patients with lung cancer and 36 patients with nonmalignant pulmonary lesions were measured for DNA index(DI), Sphase fraction (SPF) by using FACSCalibur 4200 flow cytometry. Results ① DNA index(DI) of lung cancer was ±, ± in lung cancer and nonmalignant groups, respectively. The percentage of heteroploid was % in lung cancer, % in nonmalignant. DI and the positive rate of heteroploid were significantly higher in lung cancer groups than that in nonmalignant group); ② Athough DI increased as the pathological grade and TNM stage advanced, there were no significant difference(); ③ It was demonstrated that SPF was significant higher in lung cancer groups than that in nonmalignant group. The SPF of heteroploid tumors was higher than that of diploid tumors(); SPF correlated with TNM stage and lymph node and distant metastasis(). With the increase of TNM stage, the SPF increased (). Conclusion The increase of DNA content and proliferation ability improvement were common in lung cancer; With the proliferation ability improvement, the tendency of metastasis increased;Analysis of DNA content and SPF by FCM provid a beneficial method for the evaluation of tumor biological behavior.
　　KEY WORD: lung cancer; flow cytometry; DNA content; biological characteristic
　　恶性肿瘤的染色体变化是肿瘤的基本生物学特征之一。研究表明，人类大多数肿瘤细胞的染色体都有异常，表现为染色体结构和数目的异常。异倍体的出现是恶性肿瘤的特征之一[12] 。在细胞恶变过程中因染色体的畸变使细胞DNA含量发生改变，其在肿瘤的发生、发展、转移和预后中均具有重要意义。本研究对56例肺癌及36例肺非癌性病变的新鲜组织进行流式细胞仪(FCM)DNA含量、S期细胞比值(Sphase fraction, SPF)测定，并分析DNA含量、SPF与肺癌临床病理指标的关系。
　　1 材料与方法
　　观察对象 选择2002年3月至2002年12月在我院手术切除和经纤支镜活检的肺癌标本共56例(手术切除的肺癌标本15例，经纤支镜活检的肺癌标本41例)，其中男性44例，女性12例。年龄30-78岁，平均55岁。病理类型：鳞癌33例、腺癌11例、小细胞癌12例。术前均未行任何放、化疗。TNM分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期20例、Ⅲ期23例、Ⅳ期11例。36例非癌性病变(手术切除标本15例，经纤支镜活检标本21例)，其中男性17例，女性19例。年龄13-69岁，平均46岁。均经病理检查证实为非癌性病变，其中符合结核肉芽肿10例，血管瘤2例，炎性假瘤6例，支气管黏膜慢性炎15例，鳞状化生2例，黏膜急性炎1例。
　　主要仪器与试剂 OLMPUS BP40纤支镜(日本)，OLMPUS CLEIU冷光源(日本)，FACScalibur流式细胞仪(美国BD公司)，分析用 Macintosh计算机(美国苹果公司)，Allegra 21R台式低温离心机(美国Coulter公司)。PBS缓冲液(美国Beckmancoulter公司)，组织培养液(美国BD公司)，溶血素(美国BD公司)，DNA试剂盒(美国BD公司)。
　　实验方法
　　样本制备 由手术切除和经纤支镜活检的新鲜标本约，立即置培养液中4℃冰箱保存，于1h内制成单细胞悬液(flow cytometry, FCM)备DNA检测。所有患者同时同部位另取标本置10%(体积分数)甲醛溶液中固定送病理检查。
　　流式细胞术DNA含量及细胞周期分析 将手术或纤支镜所取标本离体后立即置2mL培养液中，将组织用锐利的剪刀切碎至1mm大小，放在180目铜网上轻搓，边搓边以PBS液缓慢冲下，收集细胞悬液，以1000r/min离心沉淀5min，去上清液，加入溶血素2mL作用10min，PBS漂洗2次，离心沉淀(1000r/min，5min)，弃上清液，加入95%(体积分数)冰乙醇，配成终浓度为70%的细胞悬液固定，置4℃冰箱待检。测定前用PBS洗涤3次，弃上清液，加入A溶液250μL(内含30mg/L胰蛋白酶)混匀后静置10min，再加入B溶液(内含100mg/L Rnase A)200μL，混匀后静置10min，最后加入C溶液200μL，混匀后避光静置10min，调整细胞浓度为1×106，上机检测。使用流式细胞仪进行样本检测，测定前使用标准微球校准仪器的CV值在3以内。
　　分析指标 以DNA指数(DI值)表示DNA含量，依据DI值判定DNA倍体，≤DI≤ 为DNA二倍体；或为异倍体。DNA异倍体的判定：在DNA直方图上出现明显的两个峰且异倍体细胞群至少应含5%-10%的细胞或核同时或。同时测定SPF。
　　DI=肿瘤细胞G0/G1峰道数/正常二倍体细胞G0/G1峰道数
　　SPF(%)=[S÷(G0/G1+S+G2M)]×100%
　　病理切片的制备 以常规石蜡切片程序制片，HE染色,由病理诊断医师按照WHO肺癌国际组织学分类标准,对肺癌的细胞类型、分化进行分类。
　　统计学处理 应用统计软件包进行统计学处理，两样本均数间比较采用t检验，两样本率间比较采用χ2检验。相关分析采用spearmans法。应用单因素方差分析(OneWay ANOVA)比较肺癌各细胞类型、临床分期、病理分级间DI、SPF的差异，两两比较采用LSD法。
　　2 结果
　　不同类型组织DNA含量和增殖性 56例肺癌病变组织DI为，平均为±；SPF为，平均为±；DNA异倍体阳性率为%(44/56)；CV值,平均±。36例非癌性病变组DI ，平均为±；SPF ，平均为±；DNA异倍体阳性率为%(2/36)，CV ，平均±。 肺癌组与非癌性病变组相比，DI 、SPF、DNA异倍体阳性率差异有统计学意义()。56例肺癌中，二倍体肺癌组SPF平均为±,异倍体肺癌组SPF平均为±，两组比较差异有统计学意义()。
　　肺癌组织DNA含量、增殖性与肺癌组织学类型、组织分化程度以及临床TNM分期的关系 56例肺癌中小细胞肺癌者12例,DI、SPF平均为±、±；非小细胞肺癌44例，DI、SPF平均为±、±，两组相比差异无显着性()。44例非小细胞肺癌中有8例由于取材原因组织分化程度难以判定，仅对其中36例进行分析：高-中分化共11例(高分化8例、中分化3例)，低分化25例。随组织分化程度降低DI、SPF有增高的趋势，但两组相比差异无显着性()。56例肺癌DI随肿瘤TNM分期增加有增加的趋势，但各组间差异无显着性；肺癌各临床分期SPF分别为：Ⅰ- Ⅱ期±、Ⅲ 期±、Ⅳ期±。随临床分期增加SPF相应增加，差异有显着性()；SPF与肺癌临床分期、TNMN、TNMM有相关关系(r=，r=，r=，)。 肺癌组织DNA含量、增殖性与肺癌患者年龄、吸烟史以及肿瘤部位无明显关系。
　　3 讨论
　　DNA是染色体的主要成分，人体除少数增生代谢活跃的组织外，正常体细胞均为恒定的二倍体DNA含量。在细胞癌变的过程中，由于染色体的畸变，使细胞DNA含量也随之改变。在本实验中，56例肺癌组织的DNA含量远较非癌性病变组为高，从而证实了恶性细胞的DNA含量高于正常细胞，DNA异倍体的出现是癌变的重要标志[1] 。在本实验中，尚有%的肿瘤DNA倍体分析为正常二倍体DNA含量，原因可能与以下因素有关：①二倍体肿瘤，大量研究表明少数的肿瘤细胞可以表现为正常二倍体的DNA含量；②一些肿瘤可能同时存在染色体的丢失和复制，DNA的净含量未发生变化,异倍体无法检出来；③肿瘤细胞的异质性，造成DNA含量分布不均[34] ；④相对于二倍体来讲，异倍体细胞极少，在进行流式细胞仪检测时DNA异倍体峰被二倍体峰掩盖。
　　本组资料显示DI与肺癌部位、吸烟、病理类型、临床分期等指标间未见相关性，与Tinnemans、Pina结果相似。提示染色体的不稳定性、细胞DNA含量增高持续存在于肺癌发生、发展的各个时期。另有学者认为DI 与肺癌临床分期、病理分化程度密切相关，考虑其差别可能与病例的选择、样本大小以及取材等因素有关。此外，本组资料显示，反映细胞增殖活性的指标SPF在癌性组织中明显高于非癌性组织，且SPF与临床分期、肿瘤淋巴结转移(TNMN)、远处转移(TNMM)相关。随肺癌临床TNM分期的增加，SPF均相应增加并有统计学差异。提示良恶性组织间存在明显的增殖能力的差别，恶性组织的增殖能力明显高于非癌性病变，肺癌组织的增殖能力与肿瘤分期、浸润、转移等预后因素相关，高增殖状态的肺癌具有更大的转移潜能。本组资料显示异倍体肿瘤SPF较二倍体肿瘤高。提示恶性肿瘤间增殖能力是有差别的，相对于二倍体肿瘤，异倍体肿瘤增殖活性更高、分裂期的细胞数目
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