截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、-多克隆抗体的制备和鉴定.docx

截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、 多克隆抗体的制备和鉴定
【摘要】 目的: 构建截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达, 制备多克隆抗体。方法: 应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋白(DHBcAg 1～214aa) 的基因片段装入原核表达载体pRSETB 内, 在宿主菌Rosetta(DE3) pLacI 内进行诱导表达, 运用NiNTA方法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体, 并采用酶联免疫吸附实验(ELISA), Western blot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果: 成功地构建了含截短型DHBV核心区基因的质粒, 并纯化得到了相对分子质量(Mr)约为28 000的目的蛋白, 用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论: 获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高, 免疫反应性强; 获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性, 为DHBV的检测和研究奠定了实验基础。
【关键词】 鸭乙型肝炎病毒 核心蛋白 原核表达载体 多克隆抗体
鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA病毒科, 被广泛用于研究嗜肝DNA 病毒的复制机制、 细胞表面病毒受体、 病毒清除机制和筛选新的抗病毒药物的动物模型。DHBV主要编码外膜蛋白、 核心蛋白和P蛋白, 其中核心蛋白(DHBcAg)分子约262个氨基酸,其氨基端有装配核心颗粒, 羧基端有结合核酸的功能[1]。最近研究中, Thermet等通过对DHBcAg和HBcAg抗原决定区的比对, 得出DHBcAgAR5与HBcAgAR2相似的结论, 并结合文献报道HBcAg按其功能的不同大致可分为装配区(1～144aa)和核酸结合区(145～183/185aa)。本研究中我们将DHBcAg从AR5后的214位氨基酸截取, 构建截短型DHBV核心蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中表达, 制备多克隆抗体。
　　1 材料和方法
　　材料

　　限制性内切酶Xho I、 Pst I、 T4 DNA连接酶、 LA Taq酶、 蛋白marker、 DL 2000购自TaKaRa公司。NiNTA Spin Column kit 购自德国Qiagen公司。鼠抗His单克隆抗体和HRP标记羊抗鼠IgG为美国Santa Cruz公司产品。GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder购自立陶宛MBI公司。异丙基βD硫代半乳糖苷购自美国Promega公司。Western blot试剂盒购自Pierce公司。DYY5型双稳定时电泳仪、 DYCZ24D型迷双垂直电泳槽及DYCZ40D型迷转移槽均购自北京六一仪器厂。生物素标记羊抗鼠IgG免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。氢氧化铝佐剂购自武汉生物制品研究所。引物合成及序列测定由上海英俊生物技术有限公司完成。重组表达质粒, 含T7启动子的原核表达载体pRSETB, 宿主菌 DH5α、 表达菌 Rosetta(DE3) pLacI由本室保存。6～8周龄雌性BALB/c小
鼠, 由同济医学院实验动物中心提供。
　　方法
　　重组质粒的构建及鉴定
　　根据GenBank提供的序列分别设计上游引物CP1(2650～2668nt) 5′CCGCTCGAGGGATATCAATGCTTCTA3′, 引入酶切位点Xho I(框中部分, 下同); 下游引物CP2(250～267nt) 5′
TACACTGCAGCAGGTTCAAGTCCACGAGG3′, 引入酶切位点Pst I。以全长质粒为模板, PCR 扩增DHBcAg1～214氨基酸的编码序列, 反应的条件为: 94℃ 10 min预变性, 随后94℃ 45 s, 50℃ 45 s, 72℃ 50 s, 共30个循环, 最后72℃延伸10 min。扩增相应片段后回收纯化PCR产物用Xho I和Pst I进行酶切, 然后与同样双酶切的原核表达载体pRSETB回收纯化后, 用T4 DNA连接酶16℃连接12 h, 连接产物转化DH5α菌后挑取克隆, 用PCR和酶切法鉴定正确后进行测序分析, 该重组质粒命名pRSETBDHBc214。此载体在目的片段的N端有6个His, 以便于表达后的鉴定与纯化。
　　重组质粒的诱导表达
　　取重组质粒pRSETBDHBc214 转化到 Rosetta(DE3) pLacI, 涂板, 挑克隆, 经PCR筛选及酶切鉴定正确后将含有重组质粒的 Rosetta(DE3) pLacI接种于1 mL SOB培养液内(含100 μg/L氨苄青霉素35 μg/L氯霉素) , 37℃摇菌12 h左右,
以1∶50 比例接种到10 mL SOB培养液内, 37℃摇菌4～6 h至A600=～时加入IPTG至终浓度为2 mol/L, 37℃ 250 r/min诱导1～6 h。同时取空载体进行同样的转化、 诱导。SDSPAGE电泳分析5 h蛋白表达量最大。
　　目的蛋白的纯化(NiNTA法)
　　按方法, 诱导表达250 mL菌液, 10000 r/min(转头) 4℃离心10 min, 沉淀按5 mL/g湿质量混悬于预冷的新鲜裂解缓冲液中, 再按1 g/L加入溶菌酶, 冰浴30 min后超声破菌。溶解物4℃ 10000 g离心20 min, 收集上清及沉淀。将沉淀用NiNTA Spin Column纯化, 操作方法依照NiNTA Spin Column kit 说明进行。纯化蛋白-70℃保存。
　　目的蛋白的浓度及纯度检测
　　用Bradford检测法测定目的蛋白浓度。将目的蛋白表达过程中的各个组分进行SDSPAGE电泳, 结果进行蛋白条带灰度扫描, 并用Quantity One 软件进行纯度分析。
　　目的蛋白Western blot检测
　　空菌及空载体和重组质粒转化菌变性后经SDSPAGE分离, 将凝胶置转移缓冲液中平衡20 min, 再100 mA稳流2 h转印蛋白到硝酸纤维素膜上, PBST漂洗后用100 mL/L FBS/PBST 4℃封闭过夜。再用PBST漂洗后用50 mL/L FBS/PBST稀释的第一抗体, 37℃震荡孵育1 h, PBST漂洗3次, 加入50 mL/L FBS/PBST稀释的第二抗体, 37℃震荡孵育45 min, PBST漂洗3次, 取等量的ECL发光剂A液和B液混匀后孵育硝酸纤维素膜, 压片曝光。
　　动物免疫
　　将纯化得到的目的蛋白200 μg溶于500 μL PBS中, 再与等体积氢氧化铝佐剂混合, 按40 μg/只的抗原剂量, 分别免疫5只
BALB/c小鼠, 皮内多点注射。第14天和第28天各加强免疫1次, 加强免疫的方法和抗原剂量同上。第35天摘小鼠眼球取血, 静置离心后分离血清, 分别检测5只小鼠血清效价。
　　抗体滴度检测
　　将NiNTA法纯化所得的目的蛋白按每孔100 μL包被酶联免疫吸附板, 4℃孵育过夜, PBST洗3
次, 50 mL/L FBS/PBST 37℃封闭2 h后加入不同稀释度的免疫小鼠血清, 37℃孵育1 h, PBST洗5 次, 加入HRP标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育45 min, PBST洗5次以四甲基联苯胺—过氧化氢系统为底物37℃显色5 min中止, 酶标仪450 nm检测。以正常小鼠血清作为阴性对照。
　　多克隆抗体特异性检测
　　(1)Western blot检测, 方法同前,纯化蛋白每孔上样量为15 μg, 第一抗体为多克隆抗体血清和鼠抗His mAb(1∶1000), 第二抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。以正常小鼠血清作对照。选用鸭肝炎组织进行免疫组织化学检测, 多克隆抗体血清稀释度为1∶8000 采用化学发光法显色。
　　2 结果
　　目的基因的获得和重组质粒的构建及鉴定PCR 产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳分离, 在640 bp左右可见特异性扩增条带。重组质粒pRSETBDHBc214经Xho I和Pst I双酶切后分别得到约2900 bp和642 bp的片段, 与预期大小一致(图1)。重组质粒测序结果同模板比较核苷酸序列同源性为100%。
　　目的蛋白表达及纯化
　　从SDSPAGE电泳发现目的蛋白诱导表达5 h后获得量最大而空菌诱导相同时间未见目的条带。超速离心后发现目的蛋白主要在沉淀中, 以包涵体的形式存在。经过NiNTA纯化发现大部分的目的蛋白位于洗脱液中而且获得到的目的蛋白纯度达到95 %。
　　目的蛋白Western blot的检测
　　用鼠抗His mAb为第一抗体, 发现在Mr 28000处, 空菌和空载体菌均无条带, 重组未诱导菌仅有微弱条带, 诱导菌有较强的条带, 提示经过诱导后获得了截短型的DHBc1214目的蛋白。
　　多克隆抗体效价检测
　　纯化的重组蛋白每孔100 μL包被, ELISA法分别检测5只小鼠的抗体效价, 最高可达1∶20000。
　　多克隆抗体的特异性检测
　　Western blot检测发现, 抗DHBc1214多克隆抗体和鼠抗His抗体为第一抗体在Mr 28 000 处有明显的特异性条带, 而正常小鼠血清在该处无条带。免疫组织化学检测, 发现鸭肝炎组织有明显的阳性显色, 抗原分布主要为胞质型和胞膜型。
　　3 讨论
已知HBV核心蛋白N端的1～144位氨基酸是颗粒装配区 , 能在多种系统中表达并形成正常的球形结构。而对于DHBV, 虽然认为其氨基端有装配核心颗粒, 羧基端有结合核酸的功能, 但装配区和核酸结合区具体分界位点还不清楚。近年来, 通过对DHBV核心蛋白3D模型的建立及功能区了解的加深, 我们通过分析将DHBV核心蛋白N端的1～214氨基酸截取, 保留了DHBcAg的主要抗原决定区, 去除了与其免疫功能作用不大的C末端, 通过在大肠杆菌中的原核表达获得重组截短型鸭乙型肝炎病毒核心抗原, 并免疫BALB/c小鼠制备出多克隆抗体。该多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性, 可用于鸭乙型肝炎病毒ELISA、 Western blot和免疫组化等的检测筛选, 为进一步研究鸭乙型肝炎病毒核心蛋白的结构与功能奠定了实验基础, 也为鸭乙肝动物模型的应用提供了有用的工具。另外, 通过与HBV、 HEV和WHV截短型核心蛋白的比较[6, 7], 由于同样是去除了C末端精氨酸富集区, 推测DHBcAg 1～214氨基酸也可以形成正确的核心颗粒, 该结论还有待于进一步的研究证实。
近来研究发现, 通过接种被表达DHBcAg质粒DNA转染的原代鸭胚纤维原细胞(PDEF) 可以诱导鸭产生抗病毒免疫应答, 能够迅速阻止DHBV感染, 防止病毒感染的持续化。该研究使用的是完整DHBcAg, 而重组截短型鸭乙型肝炎病毒核心抗原具有DHBcAg的主要功能决定区, 这为合理利用截短型DHBcAg提供了一种新途径, 为深入研究DNA疫苗分子设计提供了新的思路和应用前景。
影响真核蛋白原核表达的因素很复杂, 有SD序列与起始密码ATG的距离大小、 细菌偏嗜密码子的应用、 宿主的种类与诱导表达条件等。在蛋白表达过程中, 我们发现该基因中存在一定数量的稀有密码子, 而且一些还是呈连续性分布, 这样会造成蛋白表达量极低, 或翻译提前终止。我们曾在实验中选用了 B121(DE3) plysS表达菌, 同样条件下未发现目的蛋白的产生。即使优化了培养表达条件也仍然没有目的蛋白的表达(结果未显示)。换用表达宿主菌 Rosetta(DE3) pLacI其补充了大肠杆菌6个稀有密码子tRNA, 在诱导条件均相同的情况下, 产生大量目的蛋白[10]。这提示我们在利用大肠杆菌表达外源蛋白时, 合适的表达宿主也非常关键。因此在表达蛋白时需要我们反复多次试验多种方案, 以寻找出最佳表达方式。
【参考文献】
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