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山茱萸总苷分离纯化工艺研究
【摘要】 目的应用大孔吸附树脂对山茱萸中环烯醚萜苷类成分进行分离纯化，考察大孔树脂纯化山茱萸总苷的工艺参数。方法考察上样量、洗脱剂浓度、洗脱体积、上样浓度等因素对HPD-100大孔吸附树脂纯化山茱萸环烯醚萜苷的影响。以洗脱液中莫诺苷和马钱苷含量作为考察指标，用 HPLC法测定其含量，确定最佳工艺参数。结果洗脱溶剂应为50%乙醇，大孔树脂每使用两次需要再生1次，最佳上样浓度为 g/ml，洗脱溶剂的用量为8倍的吸附原液体积，吸附容量为10 ml。结论采用大孔树脂分离纯化的山茱萸总苷可用于制备环烯醚萜苷制剂。
【关键词】 山茱萸总苷；大孔吸附树脂；高效液相色谱法；纯化
　　Abstract：ObjectiveTo study the technological parameters of purification of total glycoside from Cornus officinalis with macroporous　sample volume, elution concentration, volume and sample concentration were observed and compared with those elution solvents. The purification of iridoid glycosides was evaluated with contents of morroniside and loganin by HPLC methods．ResultsEluting solvent was 50% ethanol, the macroporous resin used twice necded to be renewed, the best sample concentration was　g/ml, the volume of eluting solvent was eight times the of volume of sample solution, the absorption capacity was 10ml. ConclusionIridiod glycoside can be purified by macroporous．It is a feasible method to produce preparation．
　　Key words：Total glycosides from Comus officinalis; Macroporous resin; HPLC; Purification

　　山茱萸总苷(Total glucosides from Cornus officinalis，TGC)为中药山茱萸的主要药效部位，包括马钱苷、莫诺苷、獐牙菜苷、马鞭草苷、山茱萸新苷等十余种环烯醚萜苷，已经证实能够降血糖并对糖尿病心脏和肾病病变有一定的保护作用［1～3］，有抗炎、免疫抑制作用［4～6］，对阿尔采末病和脑梗塞有治疗作用［7～8］。大孔吸附树脂对单味中药提取物中苷类、黄酮、生物碱的分离纯化效果良好［9，10］。本工艺应用大孔吸附树脂对山茱萸中环烯醚萜苷类成分进行分离纯化，并考察大孔树脂纯化山茱萸总苷的参数。
　　1 仪器与试药1 仪器
　　Agilent 1100 Series高效液相色谱仪；KDC-16H高速型离心机；BT125D十万分之一天平；Heidolph2旋转蒸发仪。2 药品与试剂
　　山茱萸药材购于唐山市医药药材公司；马钱苷、莫诺苷对照品；HPD-100大孔树脂；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
　　2 方法与结果
　　山茱萸吸附原液的制备
　　称取山茱萸粉200 g，加8倍量30％乙醇浸泡过夜，回流提取2次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液回收乙醇，浓缩制成每毫升相当于　g 生药的溶液，静置，滤过，即得山茱萸吸附原液，4 ℃保存备用。
　　大孔吸附树脂预处理与再生
　　大孔吸附树脂一般含有未聚合的单体及残留溶剂，使用前须先行除去。树脂用95%乙醇浸泡24 h，倾去上浮物后湿法装柱，用乙醇洗至流出液与水混合不呈现白色乳浊现象即可，然后以大量蒸馏水洗净柱中乙醇，水浸泡备用；再生时用90％乙醇洗脱至流出液无色，以大量水洗去乙醇即可。如果树脂颜色较深，用　mol/L氢氧化钠溶液浸泡 2 h，用水洗至中性，再加　mol/L盐酸溶液浸泡2 h，用水洗至中性，最后用95%乙醇洗至洗脱液与等体积水混合不浑浊，用蒸馏水洗至无醇，备用。
　　山茱萸总苷中莫诺苷和马钱苷的含量测定
　　色谱条件
　　色谱柱为Diamonsil C18色谱柱；流动相为甲醇-水溶液梯度洗脱，洗脱剂甲醇在0～8 min为32%，在8～15 min为32%～36%，在15～20 min为36%；柱温为室温；流速1 ml/min；检测波长237 nm；进样量20 μl。
　　标准曲线与线性范围
　　配制莫诺苷和马钱苷的系列对照品溶液，20 μl进样分析。以莫诺苷和马钱苷的峰面积为纵坐标，莫诺苷和马钱苷的浓度为横坐标，经回归处理得标准曲线的回归方程。其中莫诺苷为Y= 25 404C + ，马钱苷为Y= 20 518C + 。莫诺苷和马钱苷在 6 ～　mg/ml范围内线性良好。
　　HPD-100大孔树脂纯化山茱萸总苷工艺参数的研究
　　洗脱溶剂的确定
　　取HPD-100大孔树脂20 g，湿法装柱，预处理后备用。分别取　g/ml 的吸附原液 5 ml，5支大孔树脂柱上样，通过进行动态吸附。用水洗脱树脂柱至洗脱液近无色，再用10%，30%，50%，70%，95%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表1。由表1可知山茱萸总苷最佳洗脱剂为50%乙醇。
　　大孔树脂使用次数的确定
　　在“”条件下，将树脂处理后再进行第2次和第3次上样洗脱，考察树脂的重复利用情况，根据莫诺苷和马钱苷的含量确定树脂使用次数。结果见表1。由表1可知SPF-100大孔树脂的最佳洗脱次数为两次。表1 洗脱溶剂及树脂使用次数测定结果
　　最佳上样浓度的确定
　　取不同浓度的山茱萸吸附原液 5 ml，用50%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50 ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表2。由表2可知SPF-100大孔树脂的最佳上样浓度为 g/ml的吸附原液。表2 不同上样浓度的含量测定结果
　　洗脱溶剂的用量
　　分别取　g/ml的吸附原液 5 ml，大孔树脂柱上样，用水洗脱树脂柱至洗脱液近无色，再分别用50%乙醇30 ml(6倍），40 ml(8倍），50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50 ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表3。由表3可知SPF-100大孔树脂的洗脱溶剂的用量10倍的吸附原液体积，但综合考虑洗脱溶剂用量及回收溶剂等因素，可选8倍量的洗脱溶剂。表3 不同洗脱溶剂用量的含量测定结果
　　吸附容量的测定
　　分别取　g/ml的吸附原液 5，10，15，20 ml，大孔树脂柱上样，用水洗脱树脂柱至洗脱液近无色，再分别用50%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，定容50 ml，测定莫诺苷和马钱苷的含量。结果见表4。由表4可知SPF-100大孔树脂在吸附原液为5 ml时吸附最完全，但综合考虑，吸附原液为10 ml时效率最高。表4 不同吸附容量的含量测定结果
　　3 讨论
大孔树脂精制苷类具有吸附容量大、洗脱效率高等优点，使马钱苷和莫诺苷的含量提高，在预处理的前提下不失为一种提取苷类的优良吸附剂。

　　中药成分在树脂上的吸附可能为放热过程，低温有利于提高中药成分的比上柱量，因此上样前将吸附原液放冰箱低温处理可增大吸附量。吸附原液上柱前，必须进行抽滤或离心等预处理以除去沉淀和杂质，上样液愈澄清，山茱萸总苷的纯化率愈高，亦能提高树脂的使用寿命。

　　曾采用紫外法测定山茱萸总苷的含量，但是经大孔树脂富集后得到的总苷在237 nm左右并没有最大吸收峰，加上紫外法干扰多，特别是在中药成分复杂的情况下很难确定其准确性，莫诺苷和马钱苷是山茱萸总苷中含量最高的两种环烯醚萜苷，约占总苷的85％，故选用了HPLC法同时测定莫诺苷和马钱苷的方法确定山茱萸总苷的分离纯化工艺。
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