浅论大鼠股骨骨不连模型不同位点骨形态发生蛋白2基因的表达.docx

浅论大鼠股骨骨不连模型不同位点骨形态发生蛋白2基因的表达
【摘要】 目的： 观察大鼠股骨骨不连模型修复过程中骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)在各个时间段的表达情况,初步探讨单一生长因子对骨不连修复的影响。方法： SD大鼠分别于取材前35天、28天、21天、14天、7天、3天和1天建造股骨骨不连模型,同一天处死大鼠取材,RTPCR技术检测各个样本的BMP2基因的表达情况。结果： 在大鼠股骨骨不连修复过程的不同时间,BMP2基因表达在中心区和外周区存在差异,中心区BMP2基因表达滞后,表达的增幅及峰值低于边缘区。结论： 大鼠股骨骨不连中心区在修复早期BMP2基因的低表达及表达时间滞后可能是其骨不连发生的原因之一。
【关键词】 骨不连; 骨形态发生蛋白2; 大鼠
　　[Abstract] Objective: To observe the genic dynamic expression of bone morphogenetic protein2(BMP2) during restoration of rat femoral nonunion and to discuss its influence to the restoration of rat femoral nonunion. Methods： The models of femoral nonunion of SD rats were established in day 1,3,7,14,21,28,35 before we extracted the specimens, and then the genic expression of BMP2 in different repairing stage of nonunion models were detected by RTPCT technique. Results： In different stages of femoral nonunion, the genic expression of BMP2 between central zone and outer zone also varied, their expression increment and the peak level were significantly lower in the central zone than those in the outer zone,and we can find the lag in the genic expression of BMP2 in the central zone. Conclusion： Lower value and the lag in genic expression of BMP2 in the central zone during the early stage may be an important reason of nonunion occurring in rat femur.
　　[Key words] nonunion; bone morphogenetic protein2; rat
　　导致骨缺损、骨不连的原因仍不完全明了。在缺损区域促进骨形成是骨不连治疗的重要理念,在能够促使骨形成的因素中,最引人注目的是细胞因子的诱导和促进作用,其中成骨作用最为突出的是骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)。BMP2是最主要的调节骨形成的信号蛋白,BMP2基因的表达在骨的发生、诱导、修复和骨量保持方面发挥着重要而关键的作用,其表达水平的高低直接影响间充质骨细胞分化和骨量产生水平,而BMP2基因在骨不连中表达的相关报道较少。本实验通过建立大鼠股骨骨不连模型探讨骨不连修复过程中BMP2基因表达在时相和位相上差异,以初步了解BMP2基因在骨不连修复过程中的表达情况,探讨BMP2对骨不连修复可能产生的影响。
　　1 材料和方法
　　动物、试剂及仪器
　　健康SD大鼠35只,雌雄不限,体质量约350g,由江苏大学动物实验中心提供,动物使用许可证:SCXK(苏)20020045, 于本院中心实验室动物房饲养,光照昼夜交替,房间温度20～26 ℃,湿度低于80%。异丙醇、无水乙醇、氯丙醇(国药集团化学试剂有限公司),Trizol(Invitrogen公司),DEPC水(上海生工生物工程有限公司),逆转录及RTRCR试剂盒(TaKaRa公司),高速离心机(Eppendolf centrifuge 5804R,德国),紫外分光光度计(Eppendolf Biophotometer,德国),RTPCR仪器(MX3000P real time PCR，美国Stratagene公司)。
　　方 法
　　动物模型的制作 精选体质量、年龄都相当的大鼠,称重后%( ml/100 g)盐酸氯胺酮腹腔注射,麻醉成功后固定大鼠于鼠板,备皮手术区,消毒,沿肌间隙分离显露左侧股骨,于股骨干中部离断一骨段,包括骨外膜,按骨髓腔直径大小选择相应规格克氏针髓腔内固定,造成5 mm股骨骨缺损,冲洗伤口,抗生素预防感染,逐层缝合至皮肤,右侧股骨同样按上述程序处理,但不做骨缺损而直接缝合伤口,后期取材作为正常对照以计算缺损区相对于正常骨组织的相对扩增倍数。造模后大鼠置于鼠笼中自由活动,饲料正常喂养,每天观察活动和进食情况至伤口愈合。
　　实验分组 分为取材前35天、28天、21天、14天、7天、3天、1天7个时段,每个时段随机选取5只SD大鼠造模,同一天处死取材。实验组和对照组均标记骨缺损中心区和外周区。
　　RNA的提取 取出冻存标本组织,按标记的外周区和中心区分别取材。中间缺损区域定为中心区(即缺损区域中心点向远近端各 mm的范围),中心区边缘向远近端各5 mm定为边缘区(即缺损区域中心点向远近端～ mm的范围)。称重约90 mg的组织置于无菌的研钵中,液氮研磨至粉末状,按Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计测光密度值,检测各样品中总RNA的含量及纯度,-20 ℃保存。
　　引物设计 BMP2基因:上游CGGAAGCGTCTTAAGTCCAG、下游CATGCCTTAGGGATTTTGGA;β肌动蛋白基因:上游ATGTTTGAGACCTTCAACAC、下游CACGTCACACTTCATGG。
　　上述待测基因从基因库中查出,引物由上海生工设计合成。
　　逆转录 按照试剂盒说明书操作。
　　PCR反应 SYBR Green法,具体操作按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行扩增。
　　结果计算 对照组SD大鼠股骨作为阳性对照,以去离子水作为阴性对照。所有样本PCR反应均做复孔,取其平均值作为结果。以公式2-△△CT计算骨缺损模型外周区及中心区BMP2基因在相应区域相对于正常骨组织的表达倍数[1]。
　　统计学方法 利用统计软件。BMP2在各个时段外周区和中心区的表达比较,采用独立两样本t检验; BMP2在外周区和中心区各个观察时段的表达比较,用单因素方差分析,为差异有统计学意义。
　　2 结 果
　　模型建造结果
　　见图1、图2。在大鼠左侧股骨中部做骨缺损并以克氏针做内固定,35天后的实验组取材后缺损区域形成纤维连接,但没有骨性连接。
　　大体X线及病理切片
　　见图3、图4。在图3中我们可以看到骨缺损区域有模糊的软组织影,骨显影不明显,图4则证实了骨缺损区域确实没有形成骨连接。
　　BMP2基因的相对表达变化
　　见表1。在3、7、14、21、28、35天时,外周区和中心区BMP2基因的表达差异具有统计学意义,。
　　在外周区1天没有检测到表达,3天有明显表达,7天表达明显增加接近表达高峰,14天以后表达已经降低,28天至35天时表达数值接近1,即接近正常骨组织的表达。其中,3、28、35天之间表达差异无统计学意义,而其他时段之间表达差异有统计学意义,7天时的表达倍数最高,F=,。表1 大鼠骨不连模型愈合过程中BMP2基因的相对表达量
　　BMP2基因没有检测到表达以“-”表示, 在中心区,1天、3天时都没有检测到BMP2基因表达,7天可以检测到表达,14天表达明显增加并接近表达高峰,21天表达减弱,28天至35天表达在正常值附近。其中,1天和3天之间、7天和35天之间、21天和28天之间表达差异无统计学意义,其他时段之间表达差异有统计学意义,14天时的表达倍数最高,F=, 。
　　3 讨 论
　　临床上,引起骨不连的原因很多,损伤区域的局部因素是引起骨不连的始发和重要因素,这些不利因素影响骨的形成和转化,使成骨细胞难以在缺损处形成新生骨而造成骨不连。针对不同的病因,骨不连的治疗方法也各异。手术植骨仍是治疗骨不连最常用的有效方法,自体骨移植效果较好但来源有限,人工骨因缺乏相关的生长因子而诱导活性不足,现利用组织工程技术将相关生长因子置于骨不连区域为解决这一问题带来了希望,其中最重要的生长因子是BMP[2-3]。
　　BMP是有效的骨诱导因子,可以诱导间充质细胞增殖、分化为成骨细胞或软骨细胞,在骨的发生、诱导、修复等方面发挥着关键的作用。Senta等实验发现BMP2具有很强的成骨能力。Eckardt等研究证实rhBMP2可以有效地促进兔子胫骨骨不连的愈合。Hsu等将BMP2基因导入骨髓细胞(bone marrow cells,BMCs)来修复骨缺损动物模型,结果显示BMP2基因转染组的愈合明显好于单纯BMCs组。国内也有研究表明BMP2可以增加成骨细胞数量。
　　本实验在骨不连修复的不同时段,用RTPCR技术测定骨不连中心区及外周区BMP2基因的表达,发现在骨不连修复的早期,中心区BMP2基因的表达时间及达到高峰时间都要明显滞后于外周区,强度也低于外周区,该结果与Sojo等的研究相符。
　　1天时,外周区和中心区都没有检测到BMP2的表达。我们推测,骨不连模型建造后至术后1天期间,组织的缺损、血运的破坏等因素激活机体细胞信号传导系统,但此时修复效果尚不明显,BMP2基因表达在外周区和中心区均检测不到。
　　3天时,外周区可以检测到BMP2的表达,而中心区BMP2基因的表达仍未检测到。我们考虑这是由于在1天至3天期间外周区有组织和营养支持,微循环可部分建立,而中心区组织缺损、血运破坏,缺乏新生血管和成骨细胞,所以BMP2基因在外周区开始表达。
　　7天时,外周区BMP2基因表达持续增高并接近表达高峰;中心区开始检测到BMP2基因的表达。这是因为在3天至7天期间外周区骨形成主要依赖骨外膜,成骨效应比较明显,检测标本BMP2基因表达可达高峰;中心区因有部分软组织填充和血管生长及细胞因子由外周区向中心区弥散使BMP2基因在中心区开始表达。
　　14天时,外周区BMP2基因表达较7天时下降;中心区BMP2基因表达较前增高并接近表达高峰。我们考虑7天至14天期间外周区修复趋于稳定并向中心区生长延伸,在一定程度上促进了中心区的部分修复,使中心区BMP2基因表达在此时接近高峰,但基因表达和成骨效应低于外周区。
　　21天、28天及35天时,BMP2基因表达在外周区和中心区较14天时降低并逐渐趋于稳定,表达差异有所减小,但在外周区的表达始终好于中心区。我们推测21天至35天期间外周区断端向中心区生长,中心区修复进一步加强,但始终不能形成骨性连接,BMP2的低表达也不能形成有效的生物浓度刺激骨形成。
　　总之,骨不连修复早期中心区BMP2基因的表达弱于外周区,这在一定程度上不利于局部形成持续有效的BMP2浓度,难以发挥其生物学效应,导致生物网络信号联系和成骨效应链中断,从而影响骨不连的修复。
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