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浅论慢性低氧高二氧化碳对小鼠骨骼肌形态的影响
【摘要】 目的: 观察慢性低氧高二氧化碳小鼠股外侧肌显微、超微结构的变化，探讨慢性低氧高二氧化碳对小鼠骨骼肌形态的影响。方法：将C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组，实验组建立慢性低氧高二氧化碳小鼠动物模型。观察两组体重变化；光镜观察小鼠股外侧肌细胞形态、炎性细胞、脂肪细胞等变化；透射电镜观察肌纤维走向、形态及线粒体损害等超微结构变化。结果：与对照组比较，实验组小鼠体重下降；肌纤维局部萎缩，肌纤维排列紊乱；炎性细胞浸润，脂肪沉积增多；肌细胞线粒体增多伴内部结构明显破坏。结论：慢性低氧高二氧化碳血症可导致小鼠的肌纤维萎缩和线粒体损害，伴有炎性细胞浸润。
【关键词】 低氧；高碳酸血症；骨骼肌；显微结构；超微结构；小鼠
Abstract: Objective: To observe the changes of pathologic morphous and ultrastucture in the vastus lateralis of mice exposed to chronic hypoxia-hypercapnia. Methods: C57BL/6 mice were assigned randomly into control group and experiment group. Animal model of chronic hypoxia-hypercapnia was built in experiment group. Muscle cells and inflammatory cells were observed by light microscopy. The ultrasture of muscle cell and muscle’s mitochondria were observed by electron microscope. Results: Compared with that in control group， weigh losses of mice were presented in experiment group . In experiment group， muscles atrophy and derangement， inflammatory cells infiltration and increment of fatty deposition were observed. The number of mitochondria was increased and their internal structures were destroyed in experiment group. Conclusion: Mice exposure to hypoxia-hypercapnia can induce their muscles atrophy， muscles’mitochondria destroy and inflammatory cells infiltration.
Key words: hypoxia；hypercapnia；skeletal muscle；microstructure；ultrastructure；mice
慢性阻塞性肺疾病是以不完全可逆的气流受限为特征的肺部疾病，但越来越多的研究表明，COPD的病变还累及多个肺外器官。骨骼肌功能障碍是其较为突出的肺外病变之一，它严重影响COPD患者运动能力和生活质量。其发病机制仍不清楚，估计病因主要集中在肌纤维的再分布和能量代谢酶活性改变等方面[1]。本实验模拟COPD发病机制，观察在常压慢性低氧高二氧化碳条件下，小鼠股外侧肌显微、超微结构变化，旨在探讨低氧高二氧化碳对骨骼肌形态学改变的影响。
1 材料和方法
　动物与分组 SPF级C57BL/6雄性小鼠，体重20～28 g，6～8周龄，按随机数字表法分为实验组和对照组，每组8只。
　试剂与仪器 TECNAI10透射电子纤维镜，超薄切片机，戊二醛 ，四氧化锇，EPON812(分析纯，日本)，苏木素，伊红，其余为国产分析纯。
　低氧高二氧化碳小鼠模型的建立 参照陈鸣和等建立的方法。
　骨骼肌标本取材 两组动物成模后，称体重，予1%水合氯醛腹腔麻醉后处死，取小鼠右侧股外侧肌2份，1份行常规HE染色，1份电镜超薄切片。
　光镜切片的制备和观察 组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，8μm切片。切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素染色2 min，以1%盐酸酒精分化30 s，流水冲洗返蓝25 min，%伊红染色5 min，行常规脱水、封片。在HPLAS1000彩色图像处理系统下对骨骼肌炎症细胞浸润、骨骼肌纤维断裂、坏死、脂肪沉积、肌膜核内移等进行观察。
　电镜超薄切片的制备和观察 将骨骼肌标本用锋利刀片修成1 mm3组织方块，以%戊二醛电镜专用固定液固定2 h，PBS缓冲液冲洗1次，1%锇酸后固定60 min，行常规脱水、浸透、包埋、超薄切片、铅铀染色。TECNAI 10透射电镜下观察取得图像，也在图像分析系统下对骨骼肌肌纤维排列、肌纤维萎缩、纤维溶解和线粒体等进行观察。
以上光镜和电镜下观察操作均由同一位病理医生在不知道实验分组的情况下进行，参照Cross方法评分以0为无明显损害，+为轻微的损害，++为中度损害，+++为重度损害为标准进行评判，每张图像均重复观察2次保证实验可重复性和病理诊断的正确性。
　统计学处理方法 计量数据用t检验，半定量数据用卡方检验，两次观察结果用Kappa分析其结果的一致性。
　　2 结果
　对照组与实验组小鼠体重变化比较 对照组小鼠体重造模前后体重变化为g，实验组小鼠体重造模前后体重变化为g，差异有极显着性。
　骨骼肌显微结构观察 光镜下可见对照组小鼠骨骼肌肌纤维形态正常，实验组小鼠骨骼肌纤维局部萎缩，肌纤维间炎性细胞浸润增多，轻微脂肪沉积，未发现明显肌纤维断裂、坏死，肌膜核内移。肌肉显微病理严重程度评分情况见表1。
　骨骼肌超微结构观察 透射电镜下可见对照组骨骼肌肌节结构正常，肌丝排列有序，线粒体结构正常。实验组小鼠肌纤维局部明显萎缩变细，肌原纤维走行紊乱， Z线漂移，线粒体浓聚，但线粒体肿胀，排列紊乱，膜部分消失，嵴不规则断裂。肌肉超微病理严重程度评分情况见表2。
3 讨论
骨骼肌功能障碍作为COPD主要的肺外病变之一，和患者病死率等预后因素密切相关。COPD骨骼肌功能障碍的发病机制仍未完全清楚，目前为数不多的研究主要集中在临床研究。由于有众多的因素能影响COPD患者骨骼肌功能，比如：有否吸烟，戒烟时间长短，低氧高二氧化碳严重程度，发病前患者肌肉情况、营养情况，发病后伴发的疾病情况，治疗时有否使用糖皮质激素等，临床研究中对照组的选择标准等错综复杂，难以统一，所以不同研究者得出不同的甚至相反的研究结果，可能与此有关。因此有必要进行容易控制对照因素的基础动物研究。
本研究结果显示：与对照组相比，实验组小鼠体重下降，显微、超微镜下局部肌纤维萎缩，可以初步得出低氧高二氧化碳能造成小鼠骨骼肌萎缩，至少是局部肌萎缩的结论，而且肌纤维间脂肪细胞的沉积也间接地证明了这点。这与临床的研究结果是相符合的。慢性低氧高二氧化碳条件下骨骼肌的萎缩虽然在一定范围内能起到适应性的作用：减少局部氧耗，使肌肉纤维间毛细血管密度相对增加，缩小氧弥散距离等，但骨骼肌的萎缩势必影响骨骼肌的容积，进而导致骨骼肌肌力下降。
同时本研究也显示实验组小鼠股外侧肌肌纤维间炎性细胞浸润增多，提示COPD骨骼肌功能障碍的发病机制和炎症有密切关系。目前的临床研究也有报道称在COPD患者血液及骨骼肌本身均可以发现炎症递质和炎性细胞增多，并认为这些增多的炎症物质能通过影响骨骼肌蛋白的降解、合成或通过直接影响骨骼肌收缩导致骨骼肌功能障碍。本研究还观察到实验组小鼠骨骼肌线粒体浓聚、肿胀、排列紊乱，线粒体膜部分消失，嵴断裂。线粒体内集中了体内绝大部分与氧化代谢有关的酶，是机体的主要产能器官。肌肉有两种线粒体：①位于肌纤维之间的线粒体，②位于肌膜下的线粒体。其中肌纤维间线粒体占体内75%以上，肌肉收缩能量主要来源于此。本研究中线粒体浓聚现象可能是慢性低氧高二氧化碳下机体的一种适应性改变，但由于线粒体出现肿胀、排列紊乱、线粒体内部结构破坏等改变，从而使线粒体产生能量的能力下降，肌肉的氧化代谢能力下降，进而使骨骼肌耐力下降。这也许可以解释某些骨骼肌萎缩不明显的COPD患者出现骨骼肌功能障碍的原因。
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