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左心室流出道电活动改变中的作用
【摘要】 目的：探讨不同类型大鼠左心室流出道电活动改变与Na+K+ATPase活动之间的关系。方法：采用Wistar鼠、SpragueDawley大鼠、自发性高血压大鼠及盐性高血压大鼠，酶学方法测定其左心室流出道区域Na+K+ATPase活性。用细胞内记录方法引导该区的静息电位(RP)、动作电位幅度、0相最大除极速度(Vmax)及动作电位时程(APD)。结果:SHR的RP、APA及Vmax与Wistar鼠该三项指标相比无显着差异，但APD明显较Wistar鼠延长，Na+K+ATPase活性明显低于Wistar鼠；SD鼠各项指标与Wistar鼠无显着差异；SDSa鼠的RP、APA与SD鼠相比无显着差异，但Vmax明显低于SD鼠，APD明显缩短，Na+K+ATPase活性明显低于SD鼠，但与SHR无显着差异。结论：左心室流出道电活动改变与其Na+K+ATPase活性关系不大，可能与膜离子通透性有关。
【关键词】 不同类型大鼠；左心室流出道；电活动；Na+K+ATPase
【ABSTRACT】 Objective:To study the relationship between the electric potential of left ventricular outflow tract (LVOT) and the activity of Na+K+ATPase of LVOT from different kinds of :The activity of Na+K+ATPase of LVOT was measured by the enzymologic method in Wastar rats, SpragueDawley rats, spontaneously hypertensive rats and saline hypertensive rats. The electrophysiological parameters, resting potential (RP), amplitude of action potential (APA), maximal rate of depolarization of phase 0 (Vmax) and duration of action potential (APD) were intracellularlly :There was no significantdifference between spontaneously hypertensive rats (SHR) and Wistar rats in the RP,APA, and Vmax. But in SHR,
APD was prolonged, and the activity of Na+K+ATPase was decreased. All parameters were no of significant difference discovered between SD rats and Wistar rats. There was no significant difference between SD rats and saline hypertensive rats (SDSa) in RP and APA. But in SDSa rats, the Vmax was decreased, APD was shortened, and the activity of Na+K+ATPase was decreased. No significant difference was discovered between SDSa and SHR in the activity of Na+K+:The change of electric potential of left ventricular outflow tract from different kinds of rats seems no relationship to the activity of Na+K+ATPase. It probably contributes to the permeability of cell membrane.
【KEY WORDS】 Different kinds of rats；Left ventricular outflow tract；Action potential；Na+K+ATPase
心肌肥厚是高血压常见并发症，其发生机制尚不完全清楚。但长期心肌肥厚可引发恶性心律失常发生，为目前导致猝死的主要原因之一[1]。不同类型高血压大鼠心肌肥厚时左心室流出道自发电活动及诱发电位的特征我们已有报道[2,3]，但产生这一变化的基础尚不清楚。Na+K+ATPase做为心肌细胞膜上标志酶，对于维持细胞正常容积及跨膜电位有重要意义。心肌肥厚时其变化是否与电活动有关，少见报道。为此，本实验观察了Wistar鼠、SD鼠、自发性高血压大鼠(SHR)及盐性高血压大鼠电位特征与Na+K+ATPase活性的关系。
1 材料与方法
11 动物来源：12~16周龄SHR和Wistar鼠均购自北京中国医科院动物研究所。雄性SD大鼠，由北京医科大学动物中心提供。
12 盐性高血压大鼠模型制备：SD大鼠随机分为两组，一组为对照组喂普通水，一组为高盐组喂15%高渗盐水，其余饲养条件相同。用RBP1B型大鼠血压计测量大鼠尾动脉血压，6周后，高渗盐水组8只血压大于140mmHg，高于对照组，模型成功率80%。所用动物一般情况见表1。
表1 动物处死前基本情况
BW(g) Bp(mmHg) LVW/BWWistar(n=14) 2714±158 1057±37 249±011SD(n=10) 2631±125 1086±75 228±013SHR(n=16) 2580±175 1569±123* 359±034*SDSa(n=8) 2451±125 1472±52*# 286±016*#注：*P＜001vs Wistar and SD; #P＜005 vs SHR
13 药品：所需主要试剂乌苯苷购自华美生物工程北京分公司，ATP及其它试剂购自北京化学试剂商店。
14 标本制备
141 左心室流出道标本制备：大鼠击头致昏后，迅速取出心脏，用氧饱和的改良Locke液经冠状动脉冲洗后，从主动脉瓣的左瓣与后瓣之间剪开主动脉壁，向下将左心室剪开，尽量保留各瓣膜的完整，并以此为宽度，向下切约6mm的心室肌组织，去除周围多余组织，制成实验标本。标本心内膜向上，用不锈钢针固定在微电极浴槽的硅胶上，用氧饱和的改良Locke液进行恒温、恒速灌流，稳定10min后开始实验。
142 心肌细胞膜提取：将大鼠击头致昏速取心脏，按文献提取心肌细胞膜，取100g心肌组织，加入预冷的匀浆缓冲液SEGT液3ml，以10000转/min，上下缓慢匀浆，然后用四层纱布过滤，滤液4℃离心机10000转/min，离心20min，弃上清液，沉淀部分用1ml SEGT液悬浮。-70℃保存备用。
15 电位引导：用SDQ4刺激器，以波宽2ms、频率1Hz、二倍阈强度的方波刺激标本。玻璃微电极引导细胞内动作电位。动作电位经DWF3型微电极放大器放大后，一路输入SBR1型示波器进行观察，一路输入监听器监听，另一路经高速模数转换器输入微机，自动显示电信号，微机实时采样记录动作电位，并分析动作电位的参数指标,即静息电位、动作电位幅值、0相最大除极速度和动作电位时程。
16 Na+K+ATPase活性测定：反应终体积1ml内含TrisHCl 50,MgCl250,NaCl 100,KCl 15,乌苯苷20，ATP 40，37℃温浴10min，加酶01ml反应15min后，15%三氯醋酸终止反应，活性单位以每毫克蛋白每小时释放无机磷的微克分子数μmolPi/mgproh1表示。
17 蛋白含量测定：采用考马斯亮兰，以牛血清蛋白为标准，用721型分光光度计测定OD值，根据标准曲线计算蛋白含量。
18 统计学处理：应用Excel统计工具软件进行方差分析。对各项指标均以x±s表示，以P＜005为显着差异。
　　2 结果
21 同类型大鼠左心室流出道诱发电位特征
Wistar鼠各指标与SD大鼠各指标均无显着差异，SHR表现为APD明显长于两种正常对照鼠。SaHR与SD鼠相比Vmax减慢，APD缩短,见表2。
表2 不同类型大鼠左心室流出道动作电位特征(x±s)
RP(mv) APA(mv) Vmax(mv/s) APD(ms)Wistar 600±63 803±76 938±39 1512±79SD 618±42 825±53 982±85 1518±121SHR 603±63 829±93 850±96 2352±98*SDSa 625±35 801±46 765±53* 1273±95*#注：*P＜001 vs Wistar and SD, #P＜001 vs SHR
22 不同类型大鼠左心室流出道组织Na+K+ATPase活性
SHR大鼠心肌细胞膜Na+K+ATPase活性明显低于Wistar大鼠心肌细胞膜Na+K+ATPase活性；SDSa大鼠心肌细胞膜Na+K+ATPase活性明显低于SD大鼠心肌细胞膜Na+K+ATPase活性,均有显着差异。
图1 同类型大鼠左心室流出道组织Na+K+ATPase活性
3 讨论
心肌肥厚是心肌细胞对压力负荷持续增高的一种适应反应。目前研究表明其与血管紧张素Ⅱ、内皮素、及CaN等物质的刺激活性改变有关[5,6]，但其详细机制尚不十分清楚。我们以前研究发现SHR左心室流出道自发电活动增多，其诱发电位特征也发生改变，这种电活动改变的基础尚未见报道。众所周知细胞生物电活动有赖细胞膜两侧离子浓度及膜对离子的通透性两方面。本实验中肥厚心肌Na+K+ATPase活性降低，导致细胞膜两侧离子分布发生改变，如果说SDSa鼠Vmax降低可能与膜两侧Na+浓度差减小有关，而SHR Na+K+ATPase 也下降，但Vmax无明显改变。因此推定Na+K+ATPase活性下降不是Vmax下降的决定因素。另一方面，两种高血压鼠心肌静息电位水平均无明显改变。SHR的APD延长，SDSa的APD缩短，这些与K+流有关的数值也无一致结果。进一步说明该区域电位特征与Na+K+ATPase活性无关。由此推定，高血压心肌肥厚时细胞生物电活动与膜两侧离子浓度的改变关系不大，可能与膜对不同离子的通透性有关，其详细机制有待深入研究。
综上所述，SHR与SDSa大鼠左心室流出道Na+K+ATPase活性较其对照组明显降低，但其电活动变化特征表现不一致，因此，高血压心肌肥厚时左心室流出道区域电活动变化，尚不能用Na+K+ATPase活性改变做出很好的解释。也表明不同原因引起的心肌肥厚，在其形成过程存在复杂性和多样性，从而使心肌细胞膜的生物电特性也呈现多样性电活动改变，其机制有待进一步研究。
参考文献
1 Flesch M, Schiffer F, Zolk O, et al. Angiotensin recepter antagonism and angiotensin converting enzyme inhibition improve diastolic dysfunction and Ca2+ATPase expression in the sarcoplasmic reticulum in hypertensive cardiomyopathy［J］. J Hypertension, 1997,15(9):10011009
2 邱丽颖，焦宏，吕莉，等.自发性高血压大鼠左心室流出道自发性电活动的特征［J］.高血压杂志，2003，11：158160
3 邱丽颖，吕莉，焦宏，等.不同类型大鼠左心室流出道诱发电位特征比较［J］.高血压杂志，2004，12：165167
4 曾强，王培勇，唐朝枢，等.心纳素前体分子内调控对心肌的作用［J］.中国应用生理学杂志，1999：15，115
5 鲁伟，刘培庆，王庭槐，等.MAPK信号途径在一氧化氮抑制大鼠心肌肥厚中的作用［J］.生理学报，2001，53：32
6 Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et　calcineurin dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy［J］.Cell,1998,93:215228