浅论斑蝥酸钠对膀胱癌EJ细胞株毒性作用的研究.docx

浅论斑蝥酸钠对膀胱癌EJ细胞株毒性作用的研究
【摘要】 目的： 探讨斑蝥酸钠对膀胱癌EJ细胞株的毒性作用。 方法： 采用5，10，20 μg/ml斑蝥酸钠作用于EJ细胞株2，4，24，48 h后，观察细胞形态改变，MTT法检测药物对细胞生长的影响，流式细胞仪检测细胞增殖周期的改变以及细胞凋亡情况。 结果： 5 μg/ml斑蝥酸钠作用2，4 h后细胞无明显改变，10，20 μg/ml作用2，4 h后细胞出现水肿、空泡、核固缩以及细胞溶解现象;药物作用细胞后其抑制率显着增高();细胞周期中G2/M期延长，细胞凋亡明显增加()。 结论： 斑蝥酸钠对膀胱癌EJ细胞株有明显的毒性作用，通过诱导细胞凋亡的途径抑制细胞生长。
【关键词】 斑蝥酸钠; 膀胱癌; EJ细胞; 凋亡
[Abstract] Objective: To study the cytotoxic efficacy of sodium cantharidinate against human bladder cancer EJcell. Methods: After the bladder cancer EJcell was treated with 5，10，20 μg/ml sodium cantharidinate on 2，4，24，48 h, the cytology variation was observed and growth inhibition was estimated using MTT assay， and cell cycle perturbations or apoptosis was evaluated by flow cytometry. Results: It was no injure at 5 μg/ml sodium cantharidinate after 2-4 hours to the bladder cancer EJcell，and there were denaturalization and necrosis or collapse and death after 2-4 hours at 10，20 μg/ cell was inhibited and induced apoptosis，G2/Mphase arrest was infused. Conclusion: Sodium cantharidinate had obvious cytotoxic efficacy and inhibited growth to human bladder cancer EJcell.
　　[Key word] sodium cantharidinate; bladder cancer; EJcell; apoptosis
　　斑蝥酸钠系斑蝥素的半合成衍生物，临床多单独或联合用于中晚期恶性肿瘤如肝癌、胃癌的治疗[1-3]，与斑蝥素相比，其毒性、刺激性较小。在初步观察了斑蝥酸钠对离体膀胱组织的杀伤作用后，本实验在体外研究其对膀胱癌EJ细胞株的毒性作用及对膀胱癌细胞凋亡的诱导情况，以探讨斑蝥酸钠影响膀胱癌细胞生长的可能机制。
　　1 材料与方法
　　材 料
　　人膀胱癌EJ细胞株由北京大学泌尿外科研究所惠赠，细胞培养基为含10%灭活胎牛血清的RPMI1640(Gibco/BRL公司), 斑蝥酸钠注射液(商品名：奇宁注射液)，为贵州神奇制药有限公司生产，MTT购自北京市普京康生物工程有限公司;Annexin VFITC凋亡试剂盒为美国BD公司生产。
　　方 法
　　细胞培养
　　用含10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基，饱和湿度、5% CO2、37 ℃孵育箱中进行细胞培养，取对数生长期的细胞进行体外实验。
　　细胞形态观察及其抑制率的检测
　　选已铺成单层的处于对数生长期的细胞(2×106个细胞)，将其培养液弃去，对照组加培养液，试验组加含斑蝥酸钠 5，10，20 μg/ml浓度的培养液，每组3个孔，2，4，24，48 h观察其形态。然后每孔加入5 mg/ml浓度的MTT 20 μl ，孵育4 h后，MTT法评价其细胞毒效应，检测570 nm波长处的光密度(D)值，计算其抑制率。细胞抑制率/对照孔D(570 nm)-实验孔D(570 nm)对照孔D(570 nm)
　　细胞周期分布及凋亡的测定
　　使用6孔板接种EJ细胞2×106，加5，10 μg/ml斑蝥酸钠的培养液，24，48 h后用%胰蛋白酶消化，收集各时相细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗2次，用标记缓冲液将细胞配成1×106个/ml，取100 μl细胞悬液加入5 ml的培养管中，加入5 μl PI和5 μl AnnexinVFITC双染试剂，混匀，室温避光染色15 min，再加入标记缓冲液400 μl，用美国BD公司生产的FACS420型流式细胞仪进行分析。
　　统计学处理
　　采用Excel及SPSS 软件分析处理数据，行t检验，组间比较用单因素方差分析。
　　2 结 果
　　不同浓度斑蝥酸钠作用后细胞形态的变化
　　对照组细胞胞质均匀，胞核形态正常，边界清楚，核仁清晰可见。5 μg/ml斑蝥酸钠作用2～4 h后无明显改变，24 h后细胞出现水肿，核形态正常;10 μg/ml作用4 h后细胞水肿加重，胞质可见片状空泡改变，细胞核固缩，24 h后细胞大多数死亡;20 μg/ml作用4 h后细胞裂解死亡(图1)。a：对照组;b：5 μg/ml斑蝥酸钠作用4 h;c：5 μg/ml斑蝥酸钠作用24 h;d：10 μg/ml斑蝥酸钠作用4 h;e：10 μg/ml斑蝥酸钠作用24 h;f：20 μg/ml斑蝥酸钠作用4 h图1 斑蝥酸钠作用于膀胱癌EJ细胞株的细胞形态改变
　　MTT法检测细胞生长抑制情况
　　MTT法结果显示，斑蝥酸钠能有效抑制膀胱癌EJ细胞的生长，随着药物剂量的增加或作用时间的延长，抑制率逐渐增高，除5 μg/ml浓度的2 h与4 h时相外，各时相间抑制率比较，差异有统计学意义();除5 μg/ml与10 μg/ml在2 h时相外，各浓度间抑制率比较差异有统计学意义()，提示斑蝥酸钠对膀胱癌EJ细胞的抑制具有浓度和时间依赖性。检测结果与显微镜下观察情况相符。见表1。表1 MTT法检测不同浓度斑蝥酸钠作用EJ细胞株的抑制率
　　斑蝥酸钠对细胞周期的影响
　　各处理组细胞合成前期(G0/G1期)细胞有所减少，DNA合成期(S期)细胞数稍有增多但不明显，G2/M期细胞较对照组增多，表明细胞在G2/M期被抑制，斑蝥酸钠在5 μg/ml浓度作用24 h、48 h及10 μg/ml作用24 h中较明显，但在10 μg/ml作用48 h时，随着细胞凋亡数目的增加,大量细胞裂解死亡，G2/M期在图中表现不太明显。见图2。a：对照组;b：5 μg/ml斑蝥酸钠作用24 h;c：5 μg/ml斑蝥酸钠作用48 h;d：10 μg/ml斑蝥酸钠作用24 h;e：10 μg/ml斑蝥酸钠作用48 h图2 斑蝥酸钠作用EJ细胞株的流式细胞DNA组方图
　　药物作用后细胞凋亡率的检测结果
　　由表2可见，5 μg/ml或10 μg/ml斑蝥酸钠作用于膀胱癌EJ细胞株24 h和 48 h后诱导细胞的凋亡率与其对照组相比明显增高，且差异有统计学意义()，说明药物通过诱导细胞凋亡的形式最终达到对细胞的抑制和杀伤作用。表2 不同浓度斑蝥酸钠作用EJ细胞的凋亡率结果
　　3 讨 论
　　随着对抗癌药物的研究，人们越来越关注祖国医学中的中草药的抗癌作用，斑蝥素在抗癌方面的应用因其毒性作用而受到限制，近年来发现其与氢氧化钠共热水解生成的斑蝥酸钠具有毒副作用低、刺激性小，与化疗药物联合作用对肝癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤均有一定疗效。本实验通过使用不同浓度的斑蝥酸钠作用EJ细胞株，发现细胞出现水肿、空泡、核固缩等中毒症状，且随着斑蝥酸钠浓度的增高、作用时间的延长，中毒症状越明显。通过流式细胞术对细胞周期的观察发现，各处理组细胞合成前期细胞减少，DNA合成期细胞数有所增加，G2/M期细胞显着增加，与桂尤胜等使用斑蝥酸钠作用肝细胞癌周期变化一致，目前未见对膀胱癌增殖周期作用的报道。
　　细胞增殖抑制试验表明，斑蝥酸钠能有效抑制膀胱癌EJ细胞的生长，随着药物剂量的增加或作用时间的延长，抑制率逐渐增高，与显微镜下观察细胞形态结果一致。也与细胞周期延长相符。赵航宇等曾使用斑蝥酸钠维生素B6诱导肝癌细胞HepG2凋亡，检测其对肝癌细胞的抑制作用，其结果与本实验抑制膀胱癌EJ细胞相吻合。
　　本实验通过使用不同浓度斑蝥酸钠在作用不同时间进行观察，发现10，20 μg/ml斑蝥酸钠作用2 h或4 h后，大多数EJ细胞胞质消失、胞核溶解破坏。细胞的抑制率也出现了显着性差异，说明此药物浓度对膀胱癌细胞具有很好的杀伤作用。斑蝥酸钠能刺激局部免疫细胞产生白细胞介素，提高肿瘤组织局部免疫力，使膀胱组织局部抗癌作用增强，故更有助于增强灌注治疗效果。
　　浅表性膀胱癌占膀胱肿瘤的70%～80% ，因其复发率较高，术后实施抗癌药物的定期灌注，目前常用膀胱灌注药物多为丝裂霉素C和卡介苗等，本实验通过不同浓度的斑蝥酸钠作用于膀胱癌EJ细胞不同时间段杀伤作用的观察与研究，为斑蝥酸钠治疗膀胱癌尤其是膀胱灌注治疗浅表性膀胱癌提供了实验依据。
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