杭白芷多糖体外抗氧化活性的研究.docx

杭白芷多糖体外抗氧化活性的研究【摘要】 目的观察杭白芷多糖体外抗氧化作用。方法羟自由基由Fenton反应体系产生，超氧阴离子自由基由邻苯三酚自氧化法产生，硫代巴比妥酸法测定肝匀浆丙二醛相对含量来反映PAD对脂质过氧化的影响。结果PAD能清除OH和O2，并抑制LPO，达到50清除率或抑制率所需药物浓度分别为，和 mg/ml；维生素C清除OH和O2以及抑制LPO的EC50分别为，和 mg/ml。结论PAD具有体外抗氧化作用，但其活性较维生素C弱。【关键词】 杭白芷； 多糖； 羟自由基； 超氧阴离子自由基； 脂质过氧化Abstract：ObjectiveTo investigate the antioxidative effects of polysaccharide from Radix Angelicae Dahurica (PAD) in vitro. MethodsHydroxyl free radical (OH) was produced by Fenton reaction and superoxide anion free radical(O2) was produced by the oxidation of pyrogallol. The inhibition on lipid peroxidation was determined by colorimetry for testing the relative content of MDA in liver tissue .ResultsPAD could scavenge OH and O2,and inhibit lipid peroxidation in liver tissue . The concentration of scavenging or inhibiting 50%( EC50)OH , O2 and lipid peroxidation of PAD were ,and /ml respectively；EC50 of vitamin C were ,and /ml for OH , O2 and lipid peroxidation respectively. ConclusionPAD has antioxidative effects in vitro, and the effects are not so obvious as those of vitamin C.Key words：Radix Angelicae Dahurica; Polysaccharide; Hydoxyl free radical; Superoxide anion free radical; Lipid peroxidation 杭白芷是常用中药白芷的品种之一，气芳香，味辛苦，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓之功效。对杭白芷的现代研究多集中在其所含有的香豆素类和挥发油上，具有解热镇痛、抗菌消炎、解痉平喘、降低血压等药理作用1，2，而对其中含量丰富的多糖却研究甚少。本实验提取分离杭白芷多糖并对其体外抗氧化活性进行了研究。 器材1 药材杭白芷购自安徽亳州药材市场，经本院生药学教研室周红英教授鉴定为伞形科植物杭白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss.) Shan et Yuan.的干燥根，粉碎成粗粉备用。2 试剂与仪器 维生素C，天津市凯通化学试剂有限公司，批号060108；硫酸亚铁，天津市巴斯夫化工有限公司，批号040814；水杨酸，天津市凯通化学试剂有限公司，批号061108；30%过氧化氢溶液，天津市巴斯夫化工有限公司，批号061222；Tris碱，夏斯生物有限公司，批号060517；邻苯三酚，天津市巴斯夫化工有限公司，批号050816；三氯乙酸，天津市永大化学试剂开发中心，批号051024；2-硫代巴比妥酸，国药集团化学试剂有限公司，批号041216。所用试剂均为分析纯。 752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；LD-6型离心机，上海安亨科学仪器厂； DK-8D型电热恒温水槽，上海精密实验设备有限公司；DY891电动匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司。3 动物 昆明种小鼠，雄性，体重1825 g。山东省生物制品研究所提供，实验动物质量合格证：鲁动质字20030011。2 方法与结果杭白芷多糖的提取与精制 参考文献方法3称取杭白芷粗粉150 g，加4倍量石油醚回流脱脂2次，2 h/次；滤渣加4倍量80乙醇回流提取2次，2 h/次。经脱脂、醇提后的滤渣在60烘干，分别加6倍量、5倍量、4倍量蒸馏水在95水浴中浸提3次，2 h/次，合并滤液，减压浓缩至200 ml左右。以每100 ml浓缩液加20 ml氯仿正丁醇液，剧烈振荡30 min，以4 000 rmin-1离心15 min，去除下层氯仿及中层变性蛋白，取上部水层再重复去蛋白操作，至无明显中层为止。收集去蛋白后的上部水层，加无水乙醇至溶液含醇量达80，静置过夜，以4000 rmin-1离心15 min，收集沉淀物，再依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤各两次，得多糖粗品。再以水乙醇重复沉淀纯化两次，60烘干，得白色粉末状PAD提取物 g，得率。以葡萄糖为对照品，用苯酚-硫酸法4测得提取物中总糖含量为。实验前用重蒸水溶解至所需浓度。PAD对羟自由基的清除作用采用Fenton反应体系。Fe2+催化H2O2产生羟自由基，加入水杨酸捕捉OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收5。4 ml反应体系中含 mmolL-1H2O2溶液1 ml，9 mmolL-1FeSO4溶液1 ml，9 mmolL-1水杨酸-乙醇溶液1 ml，不同浓度的供试液1 ml。最后加 mmolL-1 H2O2启动反应，37水浴反应30 min后, 以蒸馏水调零点，在510 nm波长处测定吸光度。模型对照组用重蒸水代替供试液。为消除供试液本身的吸光值，用重蒸水代替 mmolL-1H2O2溶液作为样本对照组。每个浓度组平行测定5份。测定结果以清除率表示，EC50表示清除率为50时体系中的药物浓度。按E%Ao-(Ax-Axo)/ Ao100%进行计算；以E为纵坐标，多糖或维生素C对数浓度为横坐标作图，建立回归方程，计算EC50。结果见表1。PAD对超氧阴离子自由基的清除作用采用邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在弱碱性环境中自身氧化分解产生超氧阴离子自由基，随着自发反应的进行，O2在体系中不断积累，并生成有色中间产物，导致反应液在325 nm处吸光度的变化6。取 molL-1 pH为的Tris-HCl缓冲液 ml于试管中，置25水浴预热20 min后，加不同浓度的供试液1 ml，10 mmolL-1邻苯三酚 ml，混匀后25水浴4 min，立即用8 molL-1 HClml终止反应，以的Tris-HCl缓冲液调零点，并在325 nm测定吸光度。模型对照组用重蒸水1 ml代替供试液，样本对照组用重蒸水 ml代替10 mmolL-1邻苯三酚。每个浓度组平行测定5份。清除率E和EC50的计算方法同上。结果见表2。表1 PAD对OH的清除作用表2 PAD对O2的清除作用PAD对肝匀浆脂质过氧化的影响昆明种小鼠断颈处死，迅速取肝脏，置冰冷生理盐水中洗净表面残血，去除胆囊，用滤纸吸干水分，称重。以4生理盐水在冰浴条件下制成10%小鼠肝组织匀浆，4 4 000 rmin-1，离心15 min，取上清液供实验用。 取10%肝匀浆 ml于试管中，加入不同浓度供试液 ml混匀，于37水浴温孵 h后，加入10%三氯乙酸2 ml，%硫代巴比妥酸2 ml混匀，沸水浴中反应15 min后取出，流水冷却，4 000 rmin-1离心15 min，取上清液，以生理盐水调零点，并在532 nm处测定吸光度7。模型对照组用生理盐水1 ml代替供试液，样本对照组用生理盐水1 ml代替10%肝匀浆。每个浓度组平行测定5份。测定结果以脂质过氧化抑制率表示，E和EC50的计算方法同上。结果见表3。3 讨论 氧自由基的产生与机体许多功能障碍和疾病的发生有密切关系，尤其心脑血管疾病、糖尿病、中枢神经系统慢性退行性疾病等。所以，抗自由基的药物研究近年来备受人们重视。机体在代谢过程中产生的氧自由基在某些病理条件下因代谢产物过量，对机体生物大分子如核酸、蛋白质、脂质等造成氧化性损伤。其中O2产生最早，OH对细胞的危害最大，可直接作用于生物膜上的不饱和脂肪酸，使其发生脂质过氧化反应，损伤生物膜。丙二醛是脂质过氧化反应的终产物之一，氧化损伤可引起MDA生成增加，肝脏是反映脂质过氧化较为敏感的器官，所以肝脏中MDA的含量间接反映细胞脂质过氧化程度6。在本实验中，PAD显着抑制小鼠肝匀浆MDA的产生，提示PAD能有效抑制脂质过氧化反应。表3 PAD对脂质过氧化的抑制作用本实验结果显示，PAD体外可清除Fenton反应体系产生的OH和邻苯三酚自氧化法产生的O2，并可抑制小鼠肝匀浆脂质过氧化反应，显示出较好的抗氧化活性，并呈一定的量效关系。由EC50可知，PAD清除OH的作用大约是清除O2的10倍，但OH和O2清除作用以及脂质过氧化抑制作用均较维生素C弱。PAD清除氧自由基的机制可能与多糖链结构及其羟基有关，抗脂质过氧化可能与其清除自由基效应有关。有资料表明，白芷多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖通过糖苷键联结而成8。本实验在多糖提取分离过程中尽管包括去除杂蛋白、单糖、寡糖及其他小分子物质等步骤，但所得PAD仍是一类高分子多糖的混合物，所以PAD的分级纯化以及各种组分理化性质和生物学活性的差异还有待于进一步研究。【参考文献】 1 张富强，聂 红，韦 艺，等. 白芷的化学与药理研究进展J.南京中医药大学学报，2002，18：190. 2 王德才，李 珂，徐晓燕，等. 杭白芷香豆素组分解热镇痛抗炎作用的实验研究J.中国中医药信息杂志，2005，12：36.3 刘文生，薛霖莉，卫 萍，等. 潞党参多糖的提取及含量测定J.安徽中医学院学报，2005，24：42.4 高丽君，王汉忠，崔建华，等. 苯酚-硫酸法测定白首乌中多糖含量J.山东农业大学学报，2004，35：295.5 程 超，李 伟. 几种植物水溶性多糖的体外抗氧化作用J.食品工业科技，2006，27：63.6 王 辉，孙春艳，刘 刚. 异莲心碱的体外抗氧化活性J.中国生化药物杂志，2005，26：21.7 刘培勋，高小荣，徐文清，等. 银耳碱提多糖抗氧化活性的研究J.中国生化药物杂志，2005，26：169.8 康学军，曲见松，顾忠泽. 白芷多糖的分析J.分析化学，2006，34：533.