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河南省科技攻关计划项目申 请 书姓 名： JiangDongbao 项目名称： FGFR4表达对结直肠癌细胞株生物学行为的影响及作用机制的研究 单 位： 郑州大学 联系电话： 填 报 说 明 请根据自己的专业及研究方向，针对某具体临床问题，结合所学习临床科研方法的一种或几种写出一份科研设计。完成后，文件以个人姓名命名，发至：1736601711。考核成绩依设计书优略评定。截至日期2013年11月8日。一、项目的立项依据和意义（说明国内外相关领域技术发展水平和趋势等） 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床最常见的恶性肿瘤之一。我国每年结直肠癌新发病例超过25万，死亡病例约14万，新发与死亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的20%1。局部进展期结直肠癌5年癌症相关生存率为70%，而发生远处转移的晚期结直肠癌5年生存率仅为12%，且生活质量低。目前结直肠癌新辅助化疗、辅助化疗、姑息化疗方案很多，如ECF、DCF、奥沙利铂+氟尿嘧啶、顺铂+氟尿嘧啶等，但其最核心的药物是氟尿嘧啶，在此基础上联合其他化疗药物。近年来，靶向药物在结直肠癌治疗领域的研究和应用成为一大热点，作用于EGFR的爱必妥、作用于VEGF的贝伐单抗、针对Her-2的赫赛汀等已进入胃癌治疗的临床实验中。 成纤维生长因子受体（FGFRs）是一个多基因家族,属免疫球蛋白基因超家族成员,是分布在多种细胞上的膜蛋白，FGFR家族成员有FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4。它们的特点是在胞膜外含有3个免疫球蛋白样结构域，一个疏水的跨膜结构，胞浆内含有两个呈串联结构的酪氨酸激酶功能区。FGFR13在体内是广泛分布的,而FGFR4主要在发育早期大量表达,而且主要分布在视网膜和肾脏。编码FGFR4蛋白的FGFR4基因位于5号染色体，5q35.1-qter，基因编号为2264。FGFR4蛋白是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体中的一种,在胚胎发育、组织修复和血管形成等进程中起着十分重要的作用2,3。但FGFR4在恶性肿瘤中的研究相对较少，Pubmed检索该分子在胃癌中的研究仅见几篇报道，而且研究尚不深入。但有学者认为，FGFR家族是在恶性肿瘤诊治方面是一个新兴的领域，有广阔的应用前景4。FGFR4在常见的恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、横纹肌肉瘤及肾细胞癌中均呈高表达5-7。Meijer D等报道FGFR4表达是复发性乳腺癌患者的独立的预后因素8；Milano等研究亦认为FGFR4可以预测三苯氧胺治疗乳腺癌的疗效9。Gowardhan等10 研究报道，与良性增生相比，FGFR4在前列腺癌中的表达显著上调；FGFR4的表达与Gleason评分相关；生存分析显示，FGFR4过表达与较差的预后相关，无病生存期缩短。Ho HK等对57对肝细胞肝癌组织及对应的正常组织进行real time PCR定量检测FGFR4在mRNA水平的表达，统计结果显示，FGFR4的表达与患者的主要临床病理资料无相关性，可能是由于样本量较小11。Streit等12通过免疫组化技术对137例恶性黑色素瘤组织标本进行FGFR4蛋白水平表达进行检测，结果显示，FGFR4在恶性黑色素瘤组织标本中的表达率为45%，FGFR4的表达与肿瘤临床分期、微溃疡形成、原发灶的数目、总生存期及无病生存期均有明显相关性，作者认为FGFR4蛋白的表达可作为恶性黑色素瘤进展的潜在指标。自2002年，Bange等13发现了FGFR4 Gly388Arg这一胚系多态性后，该SNP现已成为了一个研究的热点。该SNP是位于FGFR4第9外显子388密码子上，碱基G转变为A，导致了FGFR4的氨基酸序列发生了变化，即388位氨基酸由甘氨酸转变为精氨酸，该位点位于FGFR4的高度保守序列中。据报道，FGFR4 Arg388基因型并不影响肿瘤的发生过程，因为在乳腺癌患者及正常对照中，该SNP在两组中的分布比例大致相同，FGFR4 Arg388基因型均占50%左右。但在淋巴结阳性的乳腺癌患者中，FGFR4 Arg388基因型与更短的无病生存期和总生存期有关14。有报道显示，携带有Arg388等位基因的肺癌患者肿瘤发病年龄更早，差的临床分期的比例更高，生存期更短，所以FGFR4 Gly388Arg可能预测肺癌的预后15。这些发现强调了该SNP位点具有临床意义，这一推断已在头颈部癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤中得以证实3, 16-18。当然也有一些文献认为该SNP无预后价值。近来，一项随机的II期实验研究中，257例T2-4/N0-2/M0原发性乳腺癌患者接受了阿霉素和环磷酰胺（AC）或阿霉素和培美曲唑（AP），序贯多西他赛（Doc）作为新辅助化疗，多因素分析显示，FGFR4 Arg388是AC-Doc作为乳腺癌患者新辅助治疗方案病理性完全缓解的独立预后因素19。Sugiyama等发现了MT1-MMP/FGFR4这个复合物，其中FGFR4 R388等位基因可通过减少溶酶体对MT1-MMP的降解而增加对胶原蛋白的侵袭；通过siRNA下调MT1-MMP或FGFR4-R388均可阻止细胞侵袭和生长20。近来一项meta分析显示，FGFR4 Gly388Arg多态性与前列腺癌的进展相关，可作为前列腺癌的进展的一个分子标记21。在目前发现的20余种成纤维生长因子（FGF）中，能与FGFR4结合的生长因子有FGF1, 2, 4, 6, 8, 9, 16, 17, 18 和 19。其中只有FGF19仅对FGFR4特异性结合22。且无论有无-Klotho存在，FGF19均可与FGFR4结合而引起后续的生物学效应23。FGFR4的激活是FGF19促进肝细胞增殖，诱导肝癌形成的机制24FGFR4在在结直肠癌中的研究甚少，故而本课题重点探讨了FGFR4的表达对结直肠癌细胞株的生物学行为的影响及作用机制。本研究为了解FGFR4对结直肠癌细胞株生物学特性的影响，进行了体外功能实验，通过慢病毒转染技术下调FGFR4的表达，然后进行了一系列功能实验，包括增殖实验、克隆实验、侵袭实验、划痕实验、流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化，western blot检测凋亡及细胞周期相关蛋白在干扰前后的变化，初步探讨FGFR4影响结直肠癌细胞株生物学行为的机制。1.International Agency for Research On Cancer. World Health Organization. GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence,Mortality and Prevalence Worldwide in 2012EB/OL 2014-12-5.2. Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 2005; 16:13949.3. Wang J, Stockton DW, Ittmann M. The fibroblast growth factor receptor-4 Arg388 allele is associated with prostate cancer initiation and progression. Clin Cancer Res 2004;10:616978.4. Katoh M. Genetic alterations of FGF receptors: an emerging field in clinical cancer diagnostics and therapeutics. Expert Rev Anticancer Ther 2010;10:1375-9.5. Jacquemier J, Adelaide J, Parc P, et al.Expression of the FGFR1 gene in human breastcarcinoma cells. Int J Cancer 1994;59:373-86. Leung HY, Gullick WJ, Lemoine NR. Expression and functional activity of fibroblast growth factors and their receptors in human pancreatic cancer. Int J Cancer 1994;59:667-75.7. Takahashi A, Sasaki H, Kim SJ, et al. Identification of receptor genes in renal cell carcinoma associated with angiogenesis by differential hybridization technique. Biochem Biophys Res Commun 1999;257:855-9. 8. Meijer D, Sieuwerts AM, Look MP, et al. Fibroblast growth factor receptor 4 predicts failure on tamoxifen therapy in patients with recurrent breast cancer. Endocr Relat Cancer. 2008;15:101-11.9. Milano A, Dal Lago L, Sotiriou C, et al. What clinicians need to know about antioestrogen resistance in breast cancer therapy. European Journal of Cancer 2006 ;42:2692705.10. Gowardhan B, Douglas DA, Mathers ME, et al. Evaluation of the fibroblast growth factor system as a potential target for therapy in human prostate cancer. Br J Cancer. 2005;92:320-7.11. Ho HK, Pok S, Streit S, et al. Fibroblast growth factor receptor 4 regulates proliferation, anti-apoptosis and alpha-fetoprotein secretion during hepatocellular carcinoma progression and represents a potential target for therapeutic intervention. 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Falvella FS, Frullanti E, Galvan A, et al.FGFR4 Gly388Arg polymorphism may affect the clinical stage of patients with lung cancer by modulating the transcriptional profile of normal lung.Int J Cancer 2009;124:2880-5.18. Tanuma J, Izumo T, Hirano M, et al. FGFR4 polymorphism, TP53 mutation, and their combinations are prognostic factors for oral squamous cell carcinoma. Oncol Rep 2010; 23:739-44.19. Marm F, Werft W, Benner A，et al. FGFR4 Arg388 genotype is associated with pathological complete response to neoadjuvant chemotherapy for primary breast cancer. Ann Oncol 2010 ;21:1636-42.20. Sugiyama N, Varjosalo M, Meller P,et al. Fibroblast growth factor receptor 4 regulates tumor invasion by coupling fibroblast growth factor signaling to extracellular matrix degradation. Cancer Res. 2010;70:7851-61.21. Xu B, Tong N, Chen SQ, et al. FGFR4 Gly388Arg polymorphism contributes to prostate cancer development and progression: A meta-analysis of 2618 cases and 2305 controls. BMC Cancer 2011; 1:84.22. Xie MH, Holcomb I, Deuel B, Dowd P, Huang A, Vagts A, Foster J, Liang J, Brush J, Gu Q, Hillan K, Goddard A, et al. FGF-19, a novel fibroblast growth factor with unique specificity for FGFR4. Cytokine 1999;11:72935.23.WuX,GeH,LemonB,etal.SelectiveactivationofFGFR4byanFGF19variantdoesnotimproveglucosemetabolisminob/obmice.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2009;106:1437984.24. Xinle Wu，Hongfei Ge，Bryan Lemon, et al.FGF19-induced Hepatocyte Proliferation Is Mediated through FGFR4 Activation. Journal of biological chemistry2010; 285:5165-70.二、项目创新点、主要研究开发内容及目标（实施方案、技术关键、技术路线和技术经济指标等）1.实施方案（1）设计4个FGFR4RNAi靶点构建到慢病毒载体，进而小量包装秤病毒颗粒。然后感染SW620和HCT116结直肠癌，通过定量PCR和Western blot法检测FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达，筛选出干扰效果最佳的siRNA，进行大量包装，形成FGFR4 siRNA稳定转染的细胞株，FGFR4持续低表达；构建FGFR4过表达慢病毒载体，进而包装成病毒颗粒, 然后感染结直肠癌细胞株，形成FGFR4 过表达细胞株，FGFR4持续高表达，以备后续功能实验。2. 对FGFR4 siRNA稳转细胞株和FGFR4 过表达细胞株，分别以各自未行处理的细胞株作为对照，进行一系列的体外功能实验，以评价FGFR4的上调和下调对结直肠癌细胞生物学行为的影响，包括增殖实验、克隆实验、侵袭实验、凋亡实验及细胞周期的变化；同时在分子水平进行Western blot检测，以显示不同处理后，细胞增殖、侵袭、凋亡及细胞周期相关蛋白表达的变化，如MMP-2、p27、CyclinD1及Bcl-xl等。3. 分别将FGFR4 siRNA稳转细胞株、FGFR4 过表达细胞株和相应的未处理的结直肠癌细胞株皮下注射至裸小鼠（nu/nu）背部, 构建成裸小鼠结直肠癌模型。接种6-8周后，观测不同处理组成瘤体积、大小等增殖指标的变化；对裸小鼠结直肠癌组织行免疫组化检测，以了解不同处理组肿瘤细胞生物学特性相关分子表达的变化。2研究方法和研究手段：1.标本来源：结直肠癌细胞株HCT116、SW620、DLD1、SW116、LS47等均购自上海中科院细胞所或ATCC，按说明书培养，利用DMEM培养基、Gibico美洲胎牛血清、100IU/ml青霉素及100ug/ml链霉素等培养细胞。BALB/c（nu-nu）裸小鼠拟购自中国科学院上海药物研究所，合格证编号：沪动合证字122号；日龄：28-32天；体重16-20；饲养于SPF级环境中。用于FGFR4 RNAi和过表达实验的慢病毒载体拟购自上海基凯公司。2利用软件设计3-4个FGFR4 RNAi靶点，构建到慢病毒载体上，进而包装成病毒颗粒，然后感染FGFR4高表达的结直肠癌细胞株，经RT-PCR和Western blot验证干扰效率，制备成FGFR4 RNAi稳转细胞株。同样，运用慢病毒载体构建FGFR4过表达结直肠癌细胞株。3.利用流式细胞仪、CCK-8及侵袭小室等对FGFR4 RNAi稳转株和FGFR4过表达细胞株进行体外功能实验，包括增殖实验、克隆实验、侵袭实验、凋亡实验及细胞周期的变化；同时在分子水平进行Western blot检测结直肠癌生物特性相关分子表达的变化。4将FGFR4 RNAi稳转株、FGFR4过表达细胞株及相应的未感染细胞株分别皮下注射入裸小鼠背部，构建成裸鼠结直肠癌模型，进行体内实验。观测成瘤体积等细胞增殖指标，利用免疫组化技术检测FGFR4不同表达的裸鼠结直肠癌模型相关分子表达的变化。3.技术路线见图一有效靶点大量包装设计4个FGFR4基因RNAi靶点构建到慢病毒载体载体小量包装慢病毒颗粒感染HCT116、SW620结直肠癌细胞株FGFR4mRNA和蛋白质的表达干扰效率满意FGFR4基因过表达慢病毒载体构建过表达载体小量包装慢病毒颗粒感染结直肠癌细胞株FGFR4mRNA和蛋白的表达qPCR和WesternBlotFGFR4过表达满意基因功能研究成瘤的体积、大小等增值指标的评价肿瘤组织MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表达的变化MMP-2、p27、CyclinD1、BCL-xl表达的变化增值、侵袭、凋亡、细胞周期变化等试验In vivoIn vitro裸鼠结直肠癌模型的构建 图一4.技术关键本课题关键技术在于FGFR4 RNAi慢病毒载体的构建及FGFR4 RNAi稳转结直肠癌细胞株的建立；FGFR4过表达慢病毒载体的构建及FGFR4 过表达结直肠癌细胞株的建立；FGFR4不同表达的裸小鼠结直肠癌模型的构建；一系列体外功能实验、体内功能实验及相关分子检测，探讨FGFR4在结直肠癌发生发展中的作用三、实施本项目已具备的条件（说明已具备的试验手段、技术力量、前期科研基础情况）（1）本课题申请人可独立进行的实验操作主要包括：新鲜标本DNA和RNA的抽提和测定；RT-PCR及real time PCR的操作和结果分析；免疫组化技术的操作和结果分析；细胞培养技术；蛋白抽提、浓度测定、western blot检测靶分子蛋白表达及结果分析；siRNA瞬时转染技术及转染效率测定；CCK-8法检测细胞增殖实验。流式细胞术的检测，细胞免疫荧光技术在实验室老师协助下完成。（2).慢病毒构建RNAi载体及过表达载体，是一些非常成熟的技术，FGFR4 RNAi稳转株和FGFR4过表达细胞株的建立可请上海吉凯公司协助完成，而该公司为专业从事介导靶分子上调和下调病毒载体的制备和包装，已和前期研究所在实验室有过多次成功合作先例；而构建裸小鼠肿瘤模型亦是一项常用的研究技术，可请相关老师指导完成。（3）本课题在叶延伟老师的带领下进行，叶老师在复旦大学附属肿瘤医院攻读肿瘤学博士学位，期间在复旦大学实验研究中心进行了为期1年的博士课题实验部分的研究，独立完成了一系列实验操作，实验结果已经发表。硕博连读期间以第一作者发表SCI论著5篇，最高IF为5.131分，累计IF达18分，分别发表于Cancer、Cancer letters、Annals of surgical oncology、Journal of surgical oncology、digestive surgery；此外，以共同作者发表国内外论著10余篇。郑州大学附属第一医院重点实验室韩超老师给予实验技术方面的帮助，韩老师是郑州大学的在职博士，实验技术精湛，经验丰富。（4）.郑州大学第一附属医院重点实验室实验设备齐全，各个实验领域均有专业实验指导员，为该研究顺利实施提供了很好的平台。四、项目的预期经济、社会和环境效益FGFR4在结直肠癌中的研究很少，而且不够深入。本课题利用慢病毒载体构建FGFR4 RNAi稳转结直肠癌细胞株和FGFR4过表达细胞株，分别下调和上调FGFR4分子的表达，进行一系列的体内和体外功能实验，从而更全面、多角度地阐述FGFR4在结直肠癌发生发展中的作用，为结直肠癌新的治疗靶点的筛选提供一些依据，目前国内外文献尚未见相关报道。五、项目实施的计划进度1. 2016年1月-2016年6月：1） 结直肠癌细胞株的培养,包括HCT116、SW620及其他常见结直肠癌细胞株；筛选出FGFR4高表达和低表达结直肠癌细胞株。2） FGFR4 RNAi慢病毒载体的构建与包装,结直肠癌细胞株SW620、HCT116的感染, qPCR和western blot反复检测FGFR4 RNAi慢病毒感染的效率，制备FGFR4 RNAi稳转结直肠癌细胞株。3）FGFR4过表达慢病毒载体的构建与包装，慢病毒颗粒感染FGFR4低表达结直肠癌细胞株，制备FGFR4过表达结直肠癌细胞株。2. 2016年7月-2016年12月：1）以FGFR RNAi稳转结直肠癌细胞株、FGFR4过表达结直肠癌细胞株和各自的未感染细胞株为研究对象，进行一系列的体外功能实验。2）利用CCK-8法进行增殖实验，克隆实验，transwell小室行侵袭实验，划痕实验，流式细胞仪检测早期凋亡和细胞株其分布的变化。3）利用Western blot法检测不同细胞增殖、侵袭、凋亡及细胞周期相关蛋白表达的变化，包括MMP-2、p27、CyclinD1及Bcl-xl等。3. 2017年1月-2017年6月1）将FGFR RNAi稳转结直肠癌细胞株、FGFR4过表达结直肠癌细胞株和各自的未感染细胞株行裸小鼠皮下注射，构建FGFR4不同表达的裸小鼠结直肠癌模型。2）行体内实验，测定成瘤体积、大小等细胞增殖的指标；免疫组化检测FGFR4不同表达的裸鼠结直肠癌标本的细胞生物学特性相关蛋白表达的变化。3）将体内体外功能实验的数据进行整理和分析，实验结果以SCI论文形式撰写，向Cancer research（IF 8.234）或Oncogene（IF 7.414）等杂志投稿。六、经费概算（1）试剂、药品耗材费 试剂名称规格数量（支）单元（元）金额（元）胎牛血清500ml5360018000MTT250mg5100500EDTA100g250100DMEM10*1L56003000胰蛋白酶1:250530150荧光二抗羊抗鼠IgG(进口)100ul215003000荧光二抗羊抗兔IgG（进口）100ul215003000LV3-FGFR4-homo-497200ul55002500LV3-FGFR4-homo-1679200ul55002500LV3-FGFR4-homo-1750200ul55002500LV3-FGFR4-homo-2074200ul55002500-actin单克隆抗体20ul2250500SDS-PAGE上样缓冲液(还原,5x)10ml2100200合计384502.试剂，动物耗材费名称规格数量单价（元）金额（元）BALB/c（nu-nu）裸小鼠501005000细胞培养瓶25T20包1002000细胞培养板96孔100个121200细胞培养板24孔5箱8004000细胞培养板6孔50个12600滤器25mm6盒3502100EP管1.5ml5包100500进口黄吸头200ul20包1002000进口蓝吸头1000ul20包1002000进口白吸头10ul10包1001000合计229003.出版物、文献、信息传播费（1.73万元）项目名称计算方法金额（元）文献检索国内文献100篇2元/篇100篇200国外文献100篇4元/篇100篇400论文发表核心期刊发表2篇1500元/篇2篇3000SCI发表1篇5000元/篇1篇5000资料打印、复印费、装订1000邮寄、快递、通讯费2000合计11600 11