超高效液相色谱三重四级杆串联质省略定饮料中11种磷酸酯类增塑剂含量.pdf

目的建立超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定饮料中 11 种磷酸酯类增塑剂含量的检测方法。方法饮料样品用乙腈液液萃取，采用 N-丙基乙二胺(PSA)进行固相基质分散净化，C18色谱柱(2.1 mm100 mm，2.5 m)分离，0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源，正离子模式进行多反应监测。结果11 种目标物的定量限在 2.5 50 g/L 之间，加标浓度范围下，平均回收率在 82.4%113.0%之间，相对标准偏差(SD)在 3.8%17.6%之间。结论该方法简单快速，灵敏度高，准确度高，可用于饮料中磷酸酯类增塑剂的风险监测。关键词:超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱;磷酸酯;增塑剂;饮料中图分类号:155文献标识码:A文章编号:1004-8456(2019)06-0528-05DOI:10.13590/jcjfh2019.06.005Simultaneous determination of organophosphate eater plasticizers used in beverageby ultra high performance liquid chromatography-triple duadrupole tandem mass spectrometryLING Yun1，YONG Wei1，HE Peixia1，2，BI Jingbo1，2，YAO Meiyi1，YAO Guihong1，ZHANG Feng1(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China;2.China Medical University，Liaoning Shenyang 110122，China)Abstract:ObjectiveA method was developed for the simultaneous determination of 11 organophosphate esterplasticizers in beverage by ultra high performance liquid chromatography-triple duadrupole tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)MethodsThe sample was liquid-liquid extracted with acetonitrile，and purified by matrix soliddispersion using primary secondary amine(PSA)The compounds were separated on a C18chromatographic column(2.1 mm100 mm，2.5 m)with the gradient elution of 0.1%formic acid aqueous solution and methanol as mobilephase The analytes were detected by electrospray ionization source in the positive ion mode and multiple reactionsmonitoring mode esultsThe result showed that the limits of quantification were in the range of 2.5-50 g/L，theaverage spiked recoveries were in the range of 82.4%-113.0%，and the relative standard deviations(SD)were in therange of 3.8%-17.6%ConclusionThis method was simple，rapid，sensitive，accurate，and could be used for themonitoring and supervision of organophosphates in beverageKey words:Ultra high performance liquid chromatography-triple duadrupole tandem mass spectrometry;organo-phosphate;plasticizer;beverage收稿日期:2019-09-12基金项目:国家重点研发计划课题(2017YFC1601305)作者简介:凌云女研究员研究方向为营养与食品卫生学E-mail:lingyun_505 163com通信作者:张峰男研究员研究方向为分析化学E-mail:fengzhang 126com食品接触材料的种类繁多，尤其是树脂类，在食品包装行业应用非常广泛，其在生产过程中会加入增塑剂、抗氧剂、光稳定剂、着色剂等添加剂以增强使用性能，但食品包装材料与食品接触过程中，这些添加剂会迁移至食品内，从而对人体健康造成威 胁。为 此 欧 盟 2002/72/EC1 以 及 我 国 GB96852016 食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准2 中规定了食品接触材料中添加剂的最大使用量及特定迁移量等指标以规范添加剂的使用。饮料作为人们生活中的日常饮品，种类繁多、消费量大，其包装材料主要为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)等材料，这些树脂产品中也会加入添加剂，对于树脂中添加剂的安全性评价是以材料中目标物在食品模拟物中的迁移量作为评价依据，但模拟物与真实样品存在差距，我国 GB 31604.12015食品安全超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时测定饮料中 11 种磷酸酯类增塑剂含量 凌云，等529国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则3 中也规定对于已与食品接触的材料及制品，应直接检测与之接触的食品中某种或某类物质的特定迁移量，因此有必要对实际样品中目标物的迁移量进行测定。有机磷酸酯类添加剂具有很好的增塑性，同时具备阻燃、润滑等功能，在家具、建材、纺织品以及食品包装材料等领域广泛使用，但由于其具有生物累积性，对人体有一定危害4-6。目前我国批准使用的食品接触用磷酸酯类增塑剂有 2 种，包括烷烃取代磷酸酯类和芳香烃取代磷酸酯类，分别为磷酸三乙酯和 2-乙基己基二苯基磷酸酯，其中 2-乙基己基二苯基磷酸酯最小特定迁移量为 2.4 mg/kg，并被限制用于接触水性食品4。其他种类如烷烃取代有机磷酸酯类 磷酸三甲酯、磷酸三正丁酯、磷酸三异丁酯、磷酸三丁氧乙酯、磷酸三(2-乙基己基)酯、卤代烷烃有机磷酸酯类 磷酸三(1-氯-2-丙基)酯、磷酸三(2-氯乙基)酯、芳香烃取代有机磷酸酯类(磷酸三甲苯酯、磷酸甲苯二苯酯)等也具有增塑功能，目前还没有列入食品接触材料及制品中添加剂的使用标准，可能被违规添加，应对其进行有效监测。目前关于有机磷酸酯类的检测方法主要为气相色谱法7-8、气相色谱-质谱法9-12、高效液相色谱-串联质谱法13-16 等。气相色谱-质谱主要对目标物的碎片离子进行检测，对于食品等基质复杂的样品，抗干扰弱，而液相色谱-三重四级杆质谱是扫描母离子和子离子的二级质谱，特异性强，具有极高的准确度及灵敏度，在食品中有害物检测领域应用非常广泛。现有方法主要针对纺织品、玩具等材料，但是土壤等环境样品以及尿液等生物标本尚没有食品中磷酸酯类化合物迁移量的测定方法。因此类药物被限制用于接触水性食品，所以本试验应用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱，建立了同时测定饮料中 11 种磷酸酯类增塑剂(6 种烷烃取代有机磷酸酯、2 种卤代烷烃有机磷酸酯、3 种芳香烃取代有机磷酸酯)含量的分析方法，为食品中此类化合物的风险监测提供技术支撑。1材料与方法1.1主要仪器与试剂超高效液相色谱仪(配有自动进样器和柱温箱，美国 Waters)，QTAP 5500 质谱仪 配备电喷雾离子源(ESI)，美国 Applied Biosystems，高速离心机，50、10 ml 玻璃离心管，不锈钢针孔过滤器(美国Millipore)。磷酸三甲酯(TMP，CAS:512-56-1)、磷酸三乙酯(TEP，CAS:78-40-0)、磷酸三正丁酯(TnBP，CAS:126-73-8)、磷酸三异丁酯(TiBP，CAS:126-71-6)、磷酸三丁氧乙酯(TBEP，CAS:78-51-3)、磷酸三(1-氯-2-丙基)酯(TCPP，CAS:13674-84-5)、磷酸三甲苯酯(TCP，CAS:563-04-2)、磷酸甲苯二苯酯(CDPP，CAS:26444-49-5)、三苯基氧化膦(TPPO，CAS:791-28-6)、磷酸三(2-乙基己基)酯(TEHP，CAS:78-42-2)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP，CAS:115-96-8)，纯度均95%，均购自德国 Ehrenstorfer。甲醇、水均为质谱级，乙腈为色谱纯，甲酸(纯度 98%)，N-丙基乙二胺(PSA，40 m，美国 Agilent)。1.2方法1.2.1标准溶液的配制准确称取上述11 种磷酸酯类标准品各0.100 0 g，用甲醇溶解并定容至 10 ml，配制成 10 mg/ml 的各标准物储备液，于20 保存。根据各化合物的响应，准确移取各标准储备液于 10 ml 容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合标准工作液，再用乙腈-水溶液(11，V/V)逐级稀释，制备系列混合标准溶液。1.2.2样品前处理取样品 2 ml 于 50 ml 玻璃离心管内(碳酸类饮料需超声脱气，有固体悬浮物类饮料需离心)，加入10 ml 乙腈，1 g NaCl 涡旋混合 2 min，4 000 r/min 离心 5 min(离心半径 6.8 cm)，取 5 ml 上清液加入0.5 g PSA 涡旋混合 2 min，4 000 r/min 离心 5 min(离心半径 6.8 cm)，取上清液过不锈钢滤膜，滤液用纯水 1 1 稀释后进样。1.2.3仪器条件色谱:Waters Xbridge T3 色 谱 柱(2.1 mm 100 mm，2.5 m)，流动相 A 为 0.1%甲酸水溶液，流动 相 B 为 甲 醇，梯 度 洗 脱 见 表 1。流 速:0.4 ml/min，进样量:5 l。表 1梯度洗脱Table 1Gradient elution时间/minA/%B/%0.0095.05.02.0095.05.06.0040.060.015.000.0100.030.000.0100.031.0095.05.035.005.05.0质谱:电喷雾离子源正离子;毛细管电压:5.5 kV;离子源温度:600;气帘气:137.9 kPa，雾化气:275.8 kPa;辅助气:275.8 kPa。各化合物采用多反应监测(MM)方式，见表 2。530中国食品卫生杂志CHINESE JOUNAL OF FOOD HYGIENE2019 年第 31 卷第 6 期表 211 种化合物的 MM 监测条件Table 2MM parameters of 11 compounds化合物母离子/(m/z)子离子/(m/z)碰撞电压/V保留时间/minTMP141.1109.1*/126.922/204.6TEP183.2127.0*/155.115/118.0TnBP267.2211.1*/155.111/1315.6TiBP267.3211.2*/155.211/1315.3TBEP399.3299.1*/199.217/2116.7TCPP329.0253.0*/175.015/1511.5TCP369.2243.0*/279.239/3618.3CDPP341.1265.1*/229.235/3515.7TPPO279.0201.1*/183.035/5110.6TEHP435.0323.3*/211.211/1425.2TCEP286.9225.0*/98.818/328.8注:*为定量离子2结果与分析2.1质谱条件的优化将待测目标物的标准工作液 50 ng/ml 通过蠕动泵，5 l/min 流速直接注入质谱进行全扫描分析，在正离子/负离子模式下，找到目标物的准分子离子峰 M+H+、M+NH4+、M+Na+、M-H等，11 种化合物均为正离子模式下进行监测，且丰度最高的准分子离子峰 M+H+作为母离子，通过子离子扫描模式，找出目标物的碎片离子，以丰度相对高的离子作为碎片离子，并对碰撞电压进行优化。以 TPPO 为例，在正离子模式下，对准分子离子峰m/z 279.0 进行二级子离子扫描，见图 1，得到主要的离子碎片 M-C6H6+H+m/z 201.1、M-C6H8O+H+m/z 183.0、M-C7H6O+H+m/z 173.1，再对碎片在 MM 监测模式下进行碰撞电压的优化，得到3 个碎片 m/z 201.1、m/z 183.0、m/z 173.1 的最优碰撞电压在分别 3040、4555、3745 V 之间。所有目标物的母离子、子离子及碰撞电压优化结果见表 2。注:左图为子离子扫描结果，右图为碰撞电压优化结果图 1TPPO 的质谱优化Figure 1Optimization of TPPO2.2液相色谱条件的优化以 11 种目标物的混合标准溶液进行优化试验。因 11 种目标物的质谱检测选择的是正离子扫描模式，甲醇和乙腈作为流动相中的有机相，对目标物的电离起到重要作用，所以首先对甲醇-水体系及乙腈-水体系进行优化试验。结果表明，使用甲醇-水体系时目标物的响应较好，而使用乙腈-水体系时，3 种氯代化合物 TCPP、TCEP、TCP 的响应降低 10 倍以上，这与在正离子模式下甲醇是质子给予试剂有关，甲醇作为流动相更有利于正离子模式下氯代磷酸酯类化合物的离子化。11 种目标物在最优条件下的谱图见图 2。图 211 种化合物谱图Figure 2Chromatography of 11 compounds超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时测定饮料中 11 种磷酸酯类增塑剂含量 凌云，等5312.3样品前处理条件的优化饮料样品中含有水溶性糖类、色素等极性干扰物，采用液液萃取的方式对 11 种目标物进行萃取，以去除水溶性杂质，进一步采用 PSA 进行净化去除极性干扰成分。在液液分配步骤中，通过加入 NaCl使乙腈相与水相分层，从乙腈相中提取出目标物。2.4线性关系、检测限和定量限配制 11 种目标物的系列混合标准溶液，以目标组分的峰面积为纵坐标、相应的质量浓度(g/L)为横坐标绘制标准曲线。结果表明，相关系数(2)均大于 0.99，各目标物在范围内具有较好的线性关系，取空白基质加标样品，根据 1.2.2 进行样品前处理，目标物信噪比(S/N)约为 10 时的信号浓度作为方法的定量限，见表 3。结果表明 11 种化合物的定量限在 2.5 50 g/L 之间，方法具有较高的灵敏度，满足特定迁移量测定要求。表 311 种化合物的线性方程、线性范围、相关系数及方法定量限Table 3Linear equation，linear，correlation coefficients and limits of quantification of 11 compounds化合物线性范围/(g/L)线性方程相关系数 2定量限/(g/L)TMP0.25 500y=8.63105x+6.921030.9992.5TEP1 100y=5.46105x+7.891040.99810TnBP0.25 125y=5.98105x+7.961040.9992.5TiBP0.5 50y=5.74105x+8.091040.9995.0TBEP0.5 50y=6.07105x+1.081050.9995.0TCPP5 1 000y=6.96104x+1.391050.99850TCP0.5 100y=4.25105x+7.921040.9995.0CDPP2.5 500y=1.93105x+8.201040.99825TPPO50 500y=3.24104x+1.931050.99250TEHP5 250y=1.98104x+6.501040.99250TCEP2.5 500y=1.69104x+1.021040.998252.5基质效应液相色谱-电喷雾质谱法中，离子源为大气压电离方式，目标物的电离受溶剂环境及离子源结构的影响较大，尽管样品前处理过程已经去除了很多杂质成分，但在研究中仍发现残存的食品基质对目标物的响应有较大的影响，因此在食品中有害物的检查方法中开展基质效应研究是必要的。本试验采用外标法定量，基质效应(ME)采用空白样品提取液配制标准溶液的标准曲线斜率(Slopea)与纯溶剂配制标准溶液的标准曲线斜率(SlopeB)之比进行评价，即 ME=(SlopeA/SlopeB)100%。ME1，表现为基质增强作用;ME1，表现为基质抑制作用。本试验采用 3 种饮料(可乐、苹果汁、乳饮料)样品考察基质效应，结果表明，11 种目标物的基质效应在1.21.8 之间，基质效应不明显，故采用溶剂标准曲线对各目标物进行定量。2.6本底的消除磷酸酯类用途广泛，属于环境污染物之一，在大气、灰尘、水体中均有残留，给高灵敏度的检测方法带来了背景干扰。本试验中发现，有两种目标物TBEP、TCP 存在背景干扰，使用质谱级水和甲醇作为流动相及采用 peek 管作为流动相的管路等，仍无法去除这两种组分。最终，在进样器和溶剂混合器间增加隔离柱，使背景干扰峰与目标物峰的保留时间不同，从而有效区分目标物及干扰峰，干扰峰的出峰时间晚于目标物，相差 0.3 min，因此提高了目标物的检测灵敏度及准确度，见图 3。图 3背景干扰的消除Figure 3Elimination of background2.7方法的回收率和精密度选择空白饮料样品按照低、中、高 3 个水平分别添加 11 种目标物的混合标准工作液，按照本试验分析方法进行测定，每个水平平行测试 6 份样品，计算每种化合物的平均回收率及相对标准偏差(SD)。结果表明，11 种目标物的平均回收率在 82.4%113.0%之间，SD 在 3.8%17.6%之间(见表 4)，本方法具有良好的准确性。532中国食品卫生杂志CHINESE JOUNAL OF FOOD HYGIENE2019 年第 31 卷第 6 期表 4空白加标试验的平均回收率和精密度(n=6)Table 4Average recoveries and relative standard deviationsof spiked test化合物加标水平/(g/L)平均回收率/%SD/%TMPTEPTnBPTiBPTBEPTCPPTCPCDPPTPPOTEHPTCEP2.5090.413.750.0103.29.2250.0103.08.410.086.315.450.097.811.5250.0102.38.42.50105.09.150.0106.83.8250.0103.43.95.00103.910.650.099.212.5250.0102.45.65.0090.212.050.096.55.8250.098.65.450.093.612.5250.0107.010.3500.0108.06.45.00107.012.650.0103.05.7250.094.04.525.096.813.850.096.53.8250.099.73.925.083.415.450.090.413.7250.0110.08.050.082.417.6250.0105.012.4500.0103.010.625.0103.217.250.0113.09.2250.099.96.92.8实际样品的测定采用本方法检测了市售的 20 份饮料样品，未有样品检出含有这 11 种磷酸酯类增塑剂。3小结本试验建立了高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定饮料中 11 种磷酸酯类增塑剂的含量。该方法准确快速，灵敏度高，应用于实际样品检测时重复性良好，可为食品中此类化合物的风险监测提供技术支撑。参考文献1欧盟委员会 2002/72/EC 关于与食品接触的材料和制品的指令S欧盟委员会，20022中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准:GB 96852016S 北京:中国标准出版社，20163中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则:GB 31604.12015S 北京:中国标准出版社，20154WEI G L，LI D Q，ZHOU M N，et al Organophosphorus flameretardants and plasticizers:sources，occurrence，toxicity andhuman exposureJ Environmental Pollution，2015，196(9):29-465FAHAT A，CUMP D，CHIU S，et al In ovo effects of twoorganophosphate flame retardantsTCPP and TDCPP-on pippingsuccess，development，mNA expression，and thyroid hormonelevels in chicken embryosJ Toxicological Sciences，2013，134(1):92-1026MEEKE J D，STAPLETON H M House dust concentrations oforganophosphate flame retardants in relation to hormone levelsand semenqualityparameters JEnvironmentalHealthPerspectives，2010，118(3):318-3237吴刚，汤富彬，赵珊红 加速溶剂萃取-气相色谱测定纺织品中磷酸酯类增塑剂J 丝绸，2014，51(3):29-338GACIA M，ODIGUEZ I，CELA Microwave assistedextraction of organophosphate flame retardants and plasticizersfrom indoor dust samplesJ Talanta，2009，79(3):824-8299望秀丽，于文佳，卫壁文，等 加速溶剂萃取-气相色谱-质谱法测定塑料中 7 种有机磷酸酯类阻燃剂和增塑剂 J 分析试验室，2017，36(1):109-113 10AAGON M，MACE M，BOULL F Determination ofphthalates and organophosphate esters in particulated materialfrom harbour air samples by pressurised liquid extraction and gaschromatography mass spectrometry J Talanta，2012，101(1):473-478 11MA Y，HITES A Electron impact，electron capture negativeionization and positive chemical ionization mass spectra oforganophosphorus flame retardants and plasticizers J Journalof Mass Spectrometry，2013，48(8):931-936 12赵海娟，张文洁，郑美玲，等 GCMS 法测定烟用包装材料中非邻苯类增塑剂J 包装工程，2019，40(9):59-65 13李佩，曾祥英，崔君涛，等 液相色谱-串联质谱法测定尿液中7 种有机磷酸酯代谢物 J 分析化学，2017，45(11):1648-1654 14CHEN D，LETCHE J，CHU S G Determination of nonhalogenated，chlorinated and brominated organophosphate flameretardants in herring gull eggs based on liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometryJ Journal of Chromatography A，2012，1220(11):169-174 15张楠，张斌，禹伟腾，等 超高效液相适配-质谱法测定纺织品中禁用的 9 种有机磷阻燃剂 J 分析试验室，2015，34(12):1411-1414 16高欣，郑如兰，戴传云，等 超高效液相色谱-质谱法测定儿童玩具中氯系有机磷酯类阻燃剂 J 分析测试学报，2013，32(12):1507-1510