单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立.pdf

单核细胞增生性李斯特菌感染 ICR 小鼠模型的建立尹海畅，吕兴锋，刘思国，王伟，王建超，孟庆文(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室实验动物研究室，黑龙江哈尔滨150001)摘要:单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种人畜共患食源性致病菌，能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD50)来评价不同 LM 菌株的致病性。为建立 LM 的 ICR小鼠模型，本研究采用 1/2a 血清型的 N21 LM 菌株，分别以 106、107、108、109和 1010CFU 的剂量口腔灌注感染 6 周龄 ICR 小鼠，每组 10 只;另取 10 只接种 PBS 作为对照组，测定 LM 对 ICR 小鼠的 LD50;另取 40 只小鼠，平均分为 2 组，公母各半，以测定的 LD50剂量接种 LM，分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价。结果发现，N21 LM菌株对 ICR 小鼠的 LD50为 109 25CFU;感染周期为 10 d 左右，感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状。组织病理学分析结果显示，肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎。菌落计数和 Real-time PCR 的检测结果发现肝脏中细菌载量最高，脾脏次之。结果表明，ICR 小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。本试验结果为研究 LM 的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗 LM 的评价奠定了基础。关键词:单核细胞增生性李斯特菌;感染;ICR 小鼠模型中图分类号:S852 61文献标识码:A文章编号:1671-7236(2013)09-0131-05单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocyto-genes，LM)是广泛存在环境中的革兰氏阳性细菌，最早于 1926 年由 Murray 从患败血症的大鼠和兔子中分离得到(Hamon 等，2006)，现已呈世界性分布;与多种动物的严重疾病有关，可引起动物不同类型的李氏杆菌病，如脑膜炎、败血症、角膜炎、肺炎、流产等(Cossart 等，2008;Czuprynski 等，2003)。为有效的预防和控制 LM 的暴发，欧美等很多国家将其列入法定的报告疾病，且建立了完善的监测系统(冯延芳等，2010);中国于 21 世纪初开始监测食品中LM 的污染。LM 共包括 13 个血清型，其中 1/2a、1/2b 和 4b 这 3 个血清型引起全世界报道的 95%的李斯特菌病病例，而其中大多数病例是由血清型 4b 菌株感染所致，为了评价和研究 LM 各相关毒力因子，通常使用 1/2a 和 1/2c 血清型的菌株(Vines 等，1998)。LM 已成为广泛研究细胞内病原菌致病机理和细胞免疫调控机制的模型。国内曾用 LM 感染绵收稿日期:2013-01-29作者简介:尹海畅(1988)，女，黑龙江人，硕士生，研究方向:病原微生物及分子生物学。通信作者:孟庆文。E-mail:mqw hvri ac cn基金项目:黑龙江省高等学校科技创新团队项目(2010td02);“十 二 五”农 村 领 域 国 家 科 技 计 划 课 题(2011AA100305-2);转基因生物新品种科技重大专项(2009ZX08006-001B)。羊，并成功的从脑、淋巴结和心血分离到该菌，建立动物感染模型;但以绵羊作为感染模型常受到价格、品种年龄及个体差异等因素的限制，且需对绵羊进行免疫抑制剂处理。目前，鼠类是最广泛的应用于研究 LM 的动物模型，且在小鼠模型上关于致病机理、毒力因子、感染强度、基因影响因子和评价 LM菌株致病性已有研究(Kazue 等，2006;Sayuri 等2011)。通过静脉注射和腹腔注射的方式接种小鼠可用来研究一些野生菌株、实验室菌株和基因改造菌株(Barbour 等，2001)，然而人和动物的李氏杆菌病大多数都是通过食用污染 LM 的食物而导致的，Czuprynski 等(2003)通过灌胃接种的方法来评价LM 对小鼠的感染，但与直接感染 LM 的天然感染途径相比仍有差异。本研究通过口腔灌注的方式接种 1/2a 血清型N21 LM 菌株感染 6 周龄 ICR 小鼠，测定临床症状、体重变化、细菌对 ICR 小鼠的 LD50、组织的细菌含量及 LM 溶血素(hly)基因拷贝数，建立 LM 的 ICR小鼠感染模型，为研究 LM 的致病机制、疫苗研发及抗菌肽转基因小鼠抗 LM 的评价奠定基础。1材料与方法1 1菌株和试验动物N21 LM 菌株由哈尔滨兽医研究所细菌室提供;5 周龄 ICR 小鼠由北京维通利华实验技术有限公司提供。1 2LM 对 ICR 小鼠 LD50的测定将菌株划线在131中国畜牧兽医2013 年第 40 卷第 9 期生理生化TSA 固体培养基上，37 温箱过夜培养。然后挑取该菌株的单一菌落于 TSB 液体培养基中 37 振荡培养 2 5 代，再重新接种至新鲜的 TSB 培养基中(1 100)，摇菌至对数期，8000 r/min 离心 5 min 收集细菌，用无菌 PBS 快速洗涤 3 次，然后悬浮细菌至 11011CFU/mL。取 60 只小鼠，公母各半。将制备好的细菌悬浮液用 PBS 缓冲液分别稀释成 1011、1010、109、108和 107CFU/mL 5 个浓度梯度，每个稀释度口腔灌注 10 只小鼠，每只 0 1 mL;对照组 10只接种 0 1 mL 无菌 PBS。观察小鼠发病与存活情况，取各组死亡小鼠做剖检和病原菌鉴定。1 3LM 对 ICR 小鼠的感染试验取 40 只小鼠，公母各半，平均分成 2 组，一组接种 LM，一组接种PBS。分别于感染后的 2、4、6 和 8 d，随机抽取 3 只存活小鼠剖杀，采集小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏等组织并保存于 80 冰箱中。同时分别于感染后的 3、6 和 9 d 随机解剖 3 只小鼠，取肝脏、脾脏和肺脏固定于 10%福尔马林液中，用于组织病理学检查。用半数致死量的细菌剂量接种小鼠，分别对各组小鼠的采食、饮水和精神状况进行观察，并做好详细记录。接种细菌前，各组小鼠称重，接种后每隔24 h 对各组小鼠进行称重，记录数据。1 4组织病理学分析用 10%福尔马林液固定组织，常规包埋，制备石蜡切片，HE 染色后镜检。15活菌计数将保留好的各组小鼠组织取出一部分，称重，加入 1 mL PBS，研磨成匀浆，梯度稀释，无菌涂布 TSA 培养基，37 温箱过夜培养，计算各组小鼠各单位组织内活菌数。1 6Real-time PCR 检测感染小鼠单位组织内细菌hly 基因的拷贝数16 1引物设计及 PCR 扩增提取细菌的基因组DNA，参考 Amagliani 等(2010)扩增 hly 基因的引物，扩增细菌的 hly 基因并检验该引物的特异性。引物序列为:hlyF:5-ACTTCGGCGCAATCAGTGA-3;hlyR:5-CAACTGCTCTTTAGTAACAG-CTT-3。PCR 扩增程序:95 预变性 10 min;95 变性 20 s，63 退火 1 min，72 延伸 20 s，40 个循环。16 2标准品的制备纯化扩增 hly 基因的 PCR产物，并插入 pMD18-T 载体，得到质粒，测序验证。用紫外分光分度计测定质粒的 D260 nm值，换算成摩尔浓度后，稀释至 1108拷贝数/L。于20 冰箱保存，使用前梯度稀释，用作阳性质粒标准品。1 6 3组织样品中细菌 hly 基因拷贝数的检测取部分剖解小鼠的组织(约 30 mg)，用试剂盒和溶菌酶提取组织的全基因组 DNA，用特异性引物hlyF、hlyR 和 Roche 公司的 SYBR Green 染料扩增hly 基因，鼠源-actin 作为内参进行校正，每个反应重复 3 次。1 7统计学处理本试验的数据以平均值标准差表示，并采用 SPSS 软件进行分析。2结果与分析2 1LM 对 ICR 小鼠 LD50的测定不同剂量 LM 感染后，小鼠死亡情况见表1。根据公式计算出 LM 对ICR 小鼠的 LD50为 109 25CFU。表 1感染小鼠死亡数目统计结果细菌数(CFU)死鼠数(只)/总数(只)死亡率(%)10109/10901094/10601082/10201070/1001060/1002 2感染小鼠体重的变化由图 1 可知，感染 LM1 d 后，小鼠的平均体重有明显的下降趋势;感染后第 6 天，小鼠的平均体重开始恢复;感染后第 10 天小鼠平均体重完全恢复到初始水平。图 1感染小鼠平均体重变化231生理生化中国畜牧兽医2013 年第 40 卷第 9 期2 3组织病理学分析组织病理学检查结果显示，感染后第 3 天，肝脏实质内出现灶状细菌团块，第 6天血栓形成，第 9 天肝细胞坏死;脾脏在感染后第 3天出现纤维素性坏死脾炎，第 6 和 9 天主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎(图 2)。图 2感染 LM 后不同时间段内小鼠各组织的病理学变化(400)2 4活菌计数感染 LM 后，在各感染天数中小鼠肝脏的细菌载量最高，脾脏次之，肾脏和脑的细菌数目较低。另外，小鼠各组织的细菌数均在感染后第2 天升高，感染后第 4 天最高，第 6 天开始下降，第 8天最低。图 3每克组织中细菌数目2 5Real-time PCR 检测感染组织中细菌 hly 基因的拷贝数2 5 1引物的选择PCR 扩增出 137 bp 的条带(图 4)，测序结果证实为目的条带，表明该引物的特异性好，可用于 Real-time PCR 的检测。图 4LM 中 hly 基因的 PCR 扩增电泳图注:M，DL2000 DNA Marker;1、2，细菌 hly 基因扩增结果。2 5 2Real-time PCR 标准曲线的制备将制备好的标准品按 10 倍倍比稀释 8 个梯度，利用 hly 基因拷贝数的对数与 Ct 值的线性关系，建立一条标准曲线。通过 Roche 480 软件进行分析，标准品的扩增曲线呈 S 型且各稀释度有均匀的间距，其相关系数合理(图 5)。由图 6 可知，标准曲线方式为:y=33657x+11 230，R2=0 9975，扩增结果具有较好的线性关系，检测数据具有相关性，表明标准曲线合格，可用于后续样品的检测。331中国畜牧兽医2013 年第 40 卷第 9 期生理生化图 5标准品的实时扩增曲线图 6标准品的标准曲线2 5 3组织样品中 LM hly 基因拷贝数的检测由图 7 可知，感染 LM 后，小鼠肝脏组织的细菌载量最高。另外，小鼠各组织内的细菌数，在感染后第 2 天升高，第 4 天最高，然后逐渐下降，与前面的菌落计数结果相符，鼠源-actin 作为内参基因进行校正，排除了模板加样量不同造成的误差。图 7每克组织内 hly 基因的拷贝数3讨论LM 的致病性与多种毒力因子有关，包括 LM 溶血素 O(listeriolysin O，LLO)、内化素(internalian)、ActA 蛋白、磷脂酶 C 及侵染型蛋白 p60 和 prfA 蛋白等，其中 LLO 由溶菌素基因 hly 编码，是该菌侵染力的重要组成成分，是 LM 的主要毒力因子(Cossart等，2002)。本试验将 hly 作为 Real-time PCR 检测感染小鼠各个组织中 LM 的目的基因，结果显示小鼠各组织内的细菌数，在感染后第 2 天升高，第 4 天最高，然后逐渐下降，与菌落计数方法检测组织中细菌载量的结果相符。Barbour 等(1996)证明了通过静脉注射测定的LM 对小鼠的 LD50明显低于灌胃注射，由于 LM 通常是通过食物传染给人和动物的，而静脉接种的途径明显绕过了调控口服细菌扩散的宿主免疫防御系统，腹腔注射也存在同样问题。本试验采取了口腔灌注的方式接种细菌，与灌胃接种相比更符合 LM的天然感染途径。Czuprynski 等(2003)通过灌胃注射方式接种 LM 发现小鼠脾脏中细菌载量高于肝脏，而本试验结果却是脾脏中细菌载量低于肝脏。这样的差异符合 Barbour 等(2001)关于不同的感染途径可能会影响随后细菌在不同组织中分布情况的阐述。本研究中测定的 1/2a 血清型 N21 LM 菌株对 6 周龄 ICR 小鼠的 LD50为 109 25CFU，LM 对小鼠的 LD50范围为 103 1010CFU，这主要因菌株的毒力、血清型、小鼠的品系和接种方式不同而异。从食物中感染的 LM 一旦进入宿主体内即能侵入宿主的免疫调节系统，在细胞内繁殖，进入淋巴和淋巴窦;同时，LM 可通过血液进一步扩散到各个组织，如肝脏和脾脏。作者从感染小鼠的肝脏、脾脏、肺脏等组织中均分离到一定数目的 LM 菌株，且接种剂量越大，小鼠的临床症状越明显，死亡率越高，各个组织中能分离到的细菌数目越多。表明高剂量的病原菌可能会打破宿主的防御系统，入侵到各个组织中，在组织中复制以达到可暴发疾病的数目，同样，低剂量的病原菌也可能在入侵到各个组织之前被宿主的防御机制清除，而不表现出疾病症状。4小结本试验采用 ICR 小鼠建立 LM 感染模型，感染431生理生化中国畜牧兽医2013 年第 40 卷第 9 期小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出、体重下降等临床症状;剖检显示肝脏、脾脏、肺脏等组织出现充血、出血点、坏死病灶等症状。这些临床症状、组织剖检与组织病理学分析均符合该病的发病特征，表明该感染模型建立成功。本研究建立的 ICR 小鼠 LM 感染模型，为研究 LM 的致病机制、疫苗研发及抗菌肽转基因小鼠抗 LM 的评价试验奠定基础。参考文献1冯延芳，冉陆，张立实 人李斯特菌病监测和预防策略研究J中国食品卫生杂志，2010，22(6):527 5302尚文婧，赵新斐，王静梅，等 新疆不同来源单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重 PCR 鉴定J 中国畜牧兽医，2012，39(8):61 633Amagliani G，Omiccioli E，Brandi G，et al A multiplex magnetic cap-ture hybridisation and multiplex Real-time PCR protocol for pathogendetection in seafood J Food Microbiology，2010，27:580 5854Barbour A H，Rampling A，Hormaeche C E Comparison of the in-fectivity of isolates of Listeria monocytogenes following intragastric andintravenous inoculation in miceJ Microbial Pathogenesis，1996，20:247 2535Barbour A H，Rampling A，Hormaeche C E Variation in the infectivi-ty of Listeria monocytogenes isolates following intragastric inoculationof miceJ Infect Immun，2001，69(7):4657 46606Cossart P Molecular and cellular basis of the infection by Listeriamonocytogenes:An overviewJ Med Microbiol，2002，291(6 7):401 4097Cossart P，Toledo-Arana A Listeria monocytogenes，a unique modelin infection biology:An overviewJ Microbes and Infection，2008，10(9):1041 10508Czuprynski C J，Nancy G A/J mice are susceptible and C57BL/6mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric in-oculation J Infect and Immune，2003，71(2):682 6899Hamon M，Bierne H，Cossart P Listeria monocytogenes:A multifac-eted modelJ Nature Reviews Microbiology，2006，4:423 43410 Sayuri C，Takeshi N，Toshiyuki H，et al Listerial invasion protein in-ternalin B promotes the entry into ileal Peyer s patches in vivoJMicrobiol Immunol，2011，55(2):123 12911 Takeuchi K，Mytle N，Lambert S，et al Comparison of Listeria mono-cytogenes virulence in a mouse modelJ Journal of Food Protection，2006，69(4):842 84612 Vines A，Bala S Identification and characterization of nucleotide se-quence differences in three virulence-associated genes of Listeriamonocytogens strains representing clinically important serotypesJCueent Microbiology，1998，36:309 318Establishment of a ICR Mice Model Infected by Listeria monocytogenesYIN Hai-chang，LV Xing-feng，LIU Si-guo，WANG Wei，WANG Jian-chao，MENG Qing-wen(Division of Laboratory Animal，National Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin VeterinaryResearch Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China)Abstract:Listeria monocytogenes(LM)was a zoonotic foodborne pathogen that could cause severe symptoms of infection in humanand animals Measuring LD50of mice models which had immune activities was widely used for evaluation of pathogenicity of LM strainsIn order to create a ICR mice model infected by LM，the N21 LM strains of the 1/2a serotype were inoculated orally into 6-week-oldICR mice groups(each group containing 10 mice)with the dose of perfusion 106，107，108，109and 1010CFU per mouse，respectively，the other 10 mice were inoculated by PBS as a control group to measure LD50of LM infecting ICR mice Another 40 mice were dividedinto two groups by gender，and inoculated with the dose of calculated LD50of LM Clinical symptoms，changes of histopathological，changes of body weight and tissue bacterial load were evaluated in each group，respectively The results found that the LD50of N21 LMwas 109 25CFU The cycle of infection was about 10 days，the infected mice showed the clinical symptoms of rough coat，listlessness，penis hanging out，weight loss，etc The histopathology analysis suggested that liver had appeared bacterial clumps in parenchyma，thrombosis and necrosis in sequence;spleen mainly showed white intramedullary lymphopenia decreased;lung mainly showed fiber sim-ply pneumonia Colony counting and Real-time PCR found that the highest bacterial load was in the liver，spleen followed The experi-mental results showed that the ICR mice could be utilized as a LM infection model This study laid the foundation for research on LMpathogenic mechanisms，vaccine development and evaluation of antimicrobial peptides transgenic mouse s resistance to Listeria mono-cytogenesKey words:Listeria monocytogenes(LM);infection;ICR mice models531中国畜牧兽医2013 年第 40 卷第 9 期生理生化