虎杖中大黄素的分离及抗菌活性的初步研究.pdf

第25卷第1期 中南民族大学学报(自然科学版)Vol.25 No.12006年3月 Journal of South2CentralU niversity for Nationalities(Nat.Sci.Edition)M ar.2006虎杖中大黄素的分离及抗菌活性的初步研究钟芳芳1李芸芳2陈玉3杨光忠13(1中南民族大学 生命科学学院民族药物研究所,武汉430074;2武汉大学 药学院,武汉430072;3中南民族大学 化学与材料科学学院,武汉430074)摘要采用pH梯度法提取虎杖中的大黄素,波谱分析鉴定其结构,然后用滤纸扩散 法及薄层色谱自显影生物技术研究其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、草分枝杆菌的抗菌效果.结果显示:大黄素对这5种细菌均有抑制作用,其在薄层色谱板上最小的抑菌量分别是:金黄色葡萄球菌为2.35g;大肠杆菌为75g;枯草芽孢杆菌为4.7g;绿脓杆菌为4.7g;草分枝杆菌为18.8g.关键词虎杖;大黄素;抑菌作用中图分类号Q2336文献标识码A文章编号167224321(2006)0120040203Isolation and Antibacterial Acticities of Emodin fromPolygonum Cusp idatumZhong Fangf angL i Yunf angChen YuYang GuangzhongAbstractThe emodin was extracted by pH gradientmethod fromPolygonum Cusp idatumand its structure was i2dentified by spectral analysis.The antibacterial acyivities of the emodin against 5 bacterial strains was studied bypaper disco diffusionmethod and thin layer chromatography bioautography technique.Itwas found that the emodinshowed activities against Bacillus subtillus,Staphylococcus aureus,M ycobacteium phlei,Escherichia coli andPseudomonas aeruginosa.It showed strong to moderate inhibitory effect on all the tested bacteriaw ith m inium in2hibition amounts on TLC plate from 2.35g to 75g.KeywordsPolygonum cusp idatum;emodin;bacteriostasisZhong FangfangM asters Candidate,College of L ife sciences,SCU FN,W uhan 430074,China虎杖(Polygonum cusp idatum),是蓼科蓼属多年生草本植物,在我国有较广泛的分布,常见于江苏、浙江、江西、福建、山东、河南、湖北、云南、贵州等中南部地区.虎杖是常用中药,性味苦平,有缓泻、破瘀通经、解毒等作用,有收敛、止血等功效1.虎杖植物的化学成分研究已较为深入,迄今已从中分离得到的化学成分主要有蒽醌、二苯乙烯类、黄酮类等2.其中蒽醌类化合物主要有大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等.大黄素有较广泛的生物活性,具有抑菌、抗炎、及免疫调节和抗肿瘤的作用3,4.本文采用pH梯度法5提取虎杖中的大黄素,并通过分析其1H NM R和13C NM R数据,确证其结构,并用滤纸扩散法6及薄层色谱自显影技术7来研究其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、草分枝杆菌的抑制作用,首次报道了大黄素在薄层色谱板上对这5种细菌的最小抑菌量,进一步确证了大黄素的抗菌活性.1材料与方法1.1植物材料虎杖购买于武汉红十字药材公司.收稿日期20052072073通讯联系人Email:作者简介钟芳芳(19832),女,硕士研究生,研究方向:天然药物化学研究,E2mail:基金项目中南民族大学引进人才科研启动基金资助项目(YZZ04002)1.2供试菌种由 本院微生物教研室提供:大肠杆菌(Es2cherichiacoli);金 黄 色 葡 菌 球 菌(S taphy locusaureus);枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis);绿脓杆菌(Pseudom onas aerug inosa);草 分 枝 杆 菌(M y2cobacterium phlei).1.3仪器与试剂Brucker AM2300核磁共振仪;薄层层析硅胶(GF254)2铝薄板,武汉药科新技术开发有限公司;水解酪蛋白琼脂,杭州微生物试剂厂,主要成分:酸水解酪蛋白,牛肉浸出粉,可溶性淀粉,琼脂;琼脂,天津市天达净化材料精细化工厂;苯酚红,天津市科密欧化学试剂开发中心;M2H培养基(M ueller2H inton Broth),杭州微生物试剂厂,主要成分:酸水解酪蛋白,牛肉浸出粉,淀粉;M2H琼脂培养基(M ueller2H inton A gar),主要成分:M uller2H inton Broth粉末,琼脂(0.7%),苯酚红(0.002%).1.4提取分离按照文献5的方法提取大黄素.1.5结构鉴定大黄素(emodin).结构式见图1.图1大黄素的结构Fig 1Structure of emodin桔红色长针晶,不溶于水,易溶于丙酮与乙醇.1H NM R(300 M Hz,DM SO2d6):7.11(1H,s,H22),7.43(1H,s,H24),7.14(1 H,d,J=1.0Hz,H25),6.66(1 H,d,J=1.0Hz,H27),2.39(3 H,s,CH3),11.99,12.06(1 H each,s,OH);13C NM R(75 M Hz,DM SO2d6):165.04(C21),121.05(C22),148.80(C23),124.69(C24),109.62(C25),162.02(C26),108.59(C27),166.48(C28),190.24(C29),181.93(C210),133.39(C24a),109.41(C28a),113.93(C29a),135.58(C210a),22.16(CH3).以上数据与文献2相符合.1.6生物活性测定1.6.1滤纸扩散法将大黄素用甲醇分别配成10、20(g?L)2种浓度的样品溶液,选用直径为6mm的灭菌滤纸片,每张滤纸片中加样品溶液10L,待溶剂挥发后,将已点样的滤纸圆片贴于已涂布上述各菌悬液100L(菌液浓度106107cfu?mL)的水解酪蛋白琼脂培养基上,放置20m in后,放入培养箱中37不光照培养,过夜,第2天测其抑菌圈大小(见表1)6.1.6.2薄层色谱自显影技术7(1)将大黄素用丙酮作溶剂配置成10 g?L,并倍比分别稀释成5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25和0.078 125 g?L共8个浓度梯度.依次取各不同浓度的大黄素溶液30L点样于层析硅胶铝薄板上,待溶剂挥发后备用.(2)制备含苯酚红(0.002%)的M2H固体培养基20mL,灭菌冷却到40左右后加入200L的新鲜菌液(菌液浓度106107cfu?mL),摇荡均匀无菌操作倒入已放上述层析硅胶薄板的培养皿,并覆盖附着大黄素的铝薄板,放置20m in,待其冷却凝固后,放入培养箱中37不光照培养,过夜,第2天喷5g?L M TT水溶液观察结果(见表2).表1大黄素对5种细菌的抑菌圈直径Tab 1Diameter of antibacterial activities against5 bacterial strains of emodin供试菌株大黄素抑菌圈氯霉素抑菌圈直径?mm100g?disc 200g?disc直径?mm30g?disc大肠杆菌71020绿脓杆菌7923枯草杆菌77.523草分枝杆菌7.51121金黄色葡萄球菌8929注:滤纸圆片直径为6mm表2大黄素在TLC板上对5种细菌的抑制效果Tab 2Antibacterial activities against 5 bacterialstrains of emodin on TLC plate供试菌株最小抑菌量?g大黄素氯霉素大肠杆菌751.25绿脓杆菌4.71.25枯草杆菌4.71.25草分枝杆菌18.80.625金黄色葡萄球菌2.350.6252结果本实验采用pH梯度法分离得到了大黄素,并14第1期钟芳芳,等:虎杖中大黄素的分离及抗菌活性的初步研究对其做了光谱分析,其碳谱和氢谱数据与文献2相一致,证实确是大黄素.然后研究了其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、草分枝杆菌5种细菌的抑菌活性.表1表明,当细菌浓度在106107cfu?mL之间时,同浓度的大黄素溶液对所给的5种菌株的抑菌效果大体一致.浓度为10g?L的大黄素溶液的抑菌圈直径在78mm范围内,浓度为20g?L的大黄素溶液的抑菌圈直径在811mm范围内,其抑菌作用随着浓度的增加而增加.表2显示大黄素对不同的菌种有不同的最小抑菌量,其对金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和绿脓杆菌的最小抑菌量相对较小,而对大肠杆菌和草分枝杆菌的最小抑菌量相对较大.大黄素对金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和绿脓杆菌最小抑菌量分别为2.35、4.7、4.7g,这一结果揭示了大黄素对金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和绿脓杆菌具有较好的抑制其生长的作用.大黄素对大肠杆菌和草分枝杆菌的最小抑菌量分别为75g和18.8g,相对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和绿脓杆菌来说,大黄素对大肠杆菌和草分枝杆菌的抑制作用较弱.比较2种方法,薄层色谱自显影技术比滤纸扩散法更加灵敏,容易观察结果,是一种较好的评价化合物抗菌活性的方法.3讨论大黄素的药敏实验表明大黄素有较强的抑菌活性,而且其毒副作用少,大黄素也是中药大黄等多种药材主要有效成分8,药源丰富.近年,从卫矛科植物雷公藤中分离到大黄素,发现其具有较强的免疫抑制作用9,而虎杖中大黄素的含量(0.6%0.7%)10比雷公藤中含量高得多,在这一方面虎杖的研究相对较少,虎杖在免疫抑制方面同样具有广泛的应用前景,值得我们做进一步的研究.参考文献1刘晓蓉.虎杖提取物抑菌作用的研究J.广州食品工业科技,2003,19(3):18220.2华燕,周建于,倪伟,等.虎杖的化学成分研究J.天然产物研究与开发,2001,13(6):16218.3阳崇德,张秀贤.大黄素的药理研究进展J.中国药业,2003,12(3):78279.4牟洪军,张绍泽,朱铁军,等.大黄素抗肿瘤作用的研究进展J.武警医学,2004,15(7):5452546.5肖崇厚.中药化学M.上海:上海科学技术出版社,1997:586.6徐叔云,卞如濂,陈修.药理学实验方法学M.北京:人民卫生出版社,2003:651.7Saxena G,Farmer S,Towers,G H N,et al.U se ofspecific dyes in the detection of anti m icrobial com2pounds from crude plant extracts using a thin layerchromatography agar overlay technique J.Phyto2chem ical analysis,1995(6):1252129.8张喜平.大黄素的药理作用研究概况J.中国药理学通报,2003,19(8):8512854.9杨春欣,董颖,马爱妞,等.雷公藤免疫抑制成分蒽醌的研究J.中国药房,2004,15(6):3322333.10刘树兴,程丽英.虎杖有效成分的开发现状及展望J.中国食品添加剂,2004(6):80282.24中南民族大学学报(自然科学版)第25卷