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油茶种子抗肿瘤有效部位群化学成分含量的分析方法
【摘要】 　　目的建立准确简便测量油茶种子中抗肿瘤有效部位群化学成分含量的分析方法。方法采用分光光度法。结果油茶种子60%丙酮-水提物中总皂苷纯度为%，总黄酮含量为%，总酚含量为%(其中鞣质占%)。结论分光光度法测定以上3种物质简便易行，准确可靠,重复性和回收率都较理想。
【关键词】 油茶种子； 抗肿瘤； 总皂苷； 黄酮； 多元酚； 鞣质
　　Abstract：ObjectiveTo establish the accurate and convenient method for determining the contents of total saponin,total flavonoids, total polyphenol and tannin in Camellia oleifera　contents were determined by spectrophotometry. ResultsThe contents of total saponin, total flavonoids, total polyphend and tannin were respectively %,%, % and %. ConclusionThe method is convenient and reliable for the determination of the three substances,and its reproducibility and recovery rate are fairly well.
　　Key words：Camellia oleifera Abel.; Anti-tumor; Saponins; Flavonoids; Polyphenols; Tannin
油茶Camellia oleifera Abel属于山茶属山茶亚属油茶组植物。中国有油茶面积3 660 000 ha，年产油茶种子645 000 t［1］，资源非常丰富。但长期以来，对油茶药用价值方面的研究，国内外鲜有报道。我们课题组在对油茶药用价值进行研究的过程中，采用MTT比色法对其种子和油粕的石油醚、乙醇、水、60%丙酮-水的梯度溶媒提取物进行体外抗癌实验，结果表明油茶种子60%丙酮-水提取物对人肺癌细胞株、人胃癌细胞株(SGC－7901)和人黑色素细胞瘤具有非常强的抑制作用。定性分析结果表明其含有大量皂苷、黄酮及多元酚类成分。为进一步明确其抗肿瘤的有效部位及有效成分,本文对该有效部位群中的三大类成分进行了定量分析,为抗肿瘤有效部位的分离纯化提供科学依据。
　　1 仪器与材料
unico7200可见分光光度计；Laborata4000型旋转蒸发仪；BP210S十万分之一电子天平；Jascov-560紫外可见分光光度计；油茶总皂苷对照品；芦丁对照品；没食子酸；所用试剂均为分析纯；水为蒸馏水；油茶种子。
　　2方法与结果
　　总皂苷的测定［2］
　　标准品溶液的制备精密称取干燥至恒重的油茶总皂苷对照品50 mg，置100 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为 mg/ml的对照品溶液，备用。
　　供试品溶液的制备精密称取干燥至恒重的样品20 mg，甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，制得浓度为 mg/ml的样品溶液，备用。
　　测定波长的选择取 ml的对照品溶液及样品溶液，分置于具塞试管中，挥去甲醇，精密加入新鲜配制的5%香草醛溶液 ml，高氯酸 ml加塞，于60℃水浴中反应15 min，取出，冰水中冷却至室温，精密加入冰乙酸 ml，摇匀立即在紫外分光光度计450～700 nm波长下扫描，同时空白溶液做参比，确定检测波长为588 nm。
　　标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液 ,,,,, ml，分置于具塞试管中，挥去甲醇，精密加入新鲜配制的5%香草醛溶液 ml，高氯酸 ml加塞，于60℃水浴中反应15 min，取出，冰水中冷却至室温，精密加入冰乙酸 ml，摇匀， 随行做空白实验，588 nm波长下测吸光度。计算得回归方程为：Y= 2(r= 9)。线性范围为～ mg/ml。
　　样品测定精密吸取供试品溶液 ml，置于具塞试管中，挥去甲醇，照标准曲线项下的方法操作，测定吸收值，从标准曲线中读出供试品溶液中总皂苷的量，计算，即得。
　　重复性实验精密吸取供试品溶液 ml置于具塞试管中，挥去甲醇，照标准曲线项下的方法操作，测定吸收值，平行测定5次，代入回归方程，计算总皂苷的含量。结果见表1。表1 总皂苷测定的重复性实验结果
　　加样回收率实验精密吸取已知总皂苷含量的供试品溶液 ml置于具塞试管中，分别加入 mg/ml的油茶总皂苷标准溶液 ml,挥去甲醇,按标准曲线绘制项下的方法操作，平行测定5次，计算加样回收率。结果见表2。表2 总皂苷测定的加样回收率实验结果
　　黄酮的含量测定［3］
　　对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，置100 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀，得浓度为 mg/ml的对照品溶液，备用。
　　供试品溶液的制备精确量取油茶60%丙酮-水提取物 7 g置100 ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 ml置100 ml容量瓶中加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为 4 mg/ml的供试品溶液。
　　测定波长的选择芦丁对照品溶液和供试品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色后，用分光光度计在200～600 nm区间进行扫描。均在500 nm处有最大吸收，因此选择500 nm为测定波长。测得的结果以芦丁为基准计算总黄酮的含量。
　　标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品溶液，，，，， ml分别置于试管中，各加甲醇至 ml，再分别加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液 ml，摇匀，室温放置5min后，再加10%硝酸铝溶液 ml，摇匀，室温放置5 min后，加入4%的氢氧化钠溶液 ml，摇匀，室温放置15 min。以相同试剂为空白在500 nm处测吸光度，以A值为纵坐标，浓度C(mg/ml)为横坐标,绘制标准曲线，得回归方程为：A=+ 8(r= 9)，线性范围为 2～ mg/ml。
　　样品测定精密吸取供试品溶液 ml置于试管中，加入甲醇至2 ml，照标准曲线项下的方法操作，测定吸收值，从标准曲线中读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得。
　　重复性实验精密吸取供试品溶液 ml置于试管中，加入甲醇至2 ml，照标准曲线项下的方法操作，测定吸收值，平行测定5次，代入回归方程，计算总黄酮的含量。结果见表3。表3 总黄酮测定的重复性实验结果
　　加样回收率实验精密吸取已知总黄酮含量的供试品溶液 ml置于试管中，分别加入芦丁对照品溶液 ml，余下部分按照标准曲线项下的方法操作，平行测定5次，计算加样回收率。结果见表4。表4 加样回收率实验结果
　　多元酚及鞣质的含量测定［4］
　　对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品10 mg，置100 ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取25 ml，置100 ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得浓度为 mg/ml的对照品溶液，备用。
　　供试品溶液的制备精密量取油茶种子60%g丙酮-水提取物干浸膏 0 g置于200 ml棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液20 ml。精密吸取续滤液5 ml置50 ml棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液Ⅰ( mg/ml)。精密吸取续滤液5 ml置于50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，倒入已盛有600 mg干酪素的具塞锥形瓶中，30℃水浴加热1 h，时时振摇，取出，放冷，过滤，弃去初滤液10 ml，续滤液作为供试品溶液Ⅱ，备用。
　　测定波长的选择没食子酸对照品溶液和供试品溶液经磷钼钨酸-碳酸钠显色后，用紫外可见分光光度计在400～1 000 nm区间进行扫描。结果表明最大吸收波长为754 nm，因此选择754 nm做为测定波长。测得的结果以没食子酸为基准计算总酚和鞣质的含量。
　　标准曲线的绘制精密吸取没食子酸标准溶液，，，， ， ml分别置于10 ml棕色量瓶中，各加水至5ml再分别加入1ml磷钼钨酸试液，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度。摇匀，以相同试剂为空白，30 min后在754 nm处测定吸光度，以A值为纵坐标，浓度C(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=+ 9，r= 8。线性范围为 7～ 2 mg/ml。
　　总酚的测定精密吸取供试品溶液Ⅰ ml置于10 ml棕色容量瓶中，照标准曲线项下的方法，自“加入1 ml磷钼钨酸试液”起，同法测定吸收值，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算，即得。
　　不被吸附的多元酚测定精密吸取供试品溶液Ⅱ　ml置于10 ml棕色容量瓶中,照标准曲线项下的方法，自“加入1 ml磷钼钨酸试液”起，同法测定吸收值，从标准曲线中读出供试品溶液中不被吸附的多酚的量，计算，即得。

　　鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量
　　重复性实验精密吸取供试品溶液Ⅰ　ml置于10 ml的棕色容量瓶中,照标准曲线绘制项下的方法操作，测定吸收值，平行测定5次，代入回归方程，计算总酚的含量，结果见表5；精密吸取供试品溶液Ⅱ 2 ml置于10 ml的棕色容量瓶中，照标准曲线项下的方法操作，测定吸收值，平行测定5次，代入回归方程，计算不被吸附的多酚的含量。结果见表6。表5 总酚测定的重复性实验结果表6 不被吸附多酚的重复性实验结果
　　加样回收率实验精确吸取已知总酚含量的供试品溶液Ⅰ1 ml和 已知不被吸附的多酚含量的供试品溶液Ⅱ2 ml置于10 ml棕色容量瓶中，分别加入 mg/ml的没食子酸标准溶液 ml，余下部分照标准曲线绘制项下的方法操作，平行测定5次，计算加样回收率。结果见表7～8。表7 总酚测定的加样回收率实验结果表8 不被吸附多酚的加样回收率实验结果
　　3讨论
皂苷的分析测定有多种方法，但分光光度法操作简便、灵敏，属于经典、成熟的方法。采用分光光度计法测定其总皂苷的含量，其结果为%。

　　以芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系为显色剂，利用分光光度法测定总黄酮含量，操作简便，灵敏度高，重复性好，结果可靠。研究结果表明油茶种子60%丙酮-水提物种总黄酮含量为%。

　　总酚与鞣质含量测定方法主要是参考了《中国药典》鞣质测定方法，以没食子酸为对照品稳定性好，干酪素吸附作用具有专属性，操作简便，且重复性和回收率都较理想。测定结果：总酚含量为%，其中鞣质为%。

　　对于在这一有效部位群中，具体是哪一类成分为抗肿瘤的有效成分及其作用的机理，本研究组正在进一步研究中。
【参考文献】
　　［1］高继银.山茶属植物主要原种彩色图集［M］.杭州:浙江科学技术出版社，2005:15.
　　［2］高声传,郭 涛,夏维杰，等.比色法测定酸枣仁提取物中总皂苷的含量［J］.实用药物与临床，2005,8(1):15.
　　［3］毕和平,韩长日,廖家旺，等.穿心莲中总黄酮含量的测定［J］.光谱实验室,2006,23(2):356.
　　［4］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］. 北京:化学工业出版社，2005：附录XB,57.