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Genistein对人卵巢癌细胞系3AO抑制增殖的作用及机制的探讨
【摘要】 目的：研究植物雌激素染料木黄酮对人卵巢癌细胞系3AO细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用，探讨其抗癌作用的机制. 方法：应用MTT法检测不同浓度染料木黄酮对3AO细胞的生长抑制作用，电镜观察药物作用后细胞的超微结构改变，TUNEL法确定凋亡，流式细胞仪检测细胞周期、定量分析凋亡，免疫细胞化学技术检测雌激素β受体的表达. 结果： 3AO细胞经不同浓度染料木黄酮处理后，细胞生长明显受到抑制，且这种抑制作用随时间延长及浓度增高而增强，10 mg/L和20 mg/L染料木黄酮作用72 h后，抑制率分别达到%和%. 染料木黄酮阻断3AO细胞生长于G2/M期，在G0/G1前出现典型亚二倍体凋亡峰，且凋亡呈时间依赖性. 电镜观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征. TUNEL法观察到大量阳性凋亡细胞. 免疫细胞化学法检测到用药后，ERβ表达明显加强. 结论：染料木黄酮对3AO细胞的生长有明显的呈时间及浓度依赖性的抑制作用，并诱导其发生凋亡. 染料木黄酮可能通过雌激素β受体途径发挥药理作用，诱导卵巢癌细胞发生凋亡.
【关键词】 染料木黄酮；卵巢肿瘤；细胞系；细胞凋亡
染料木黄酮是异黄酮类化合物，化学名为4′，5，7三羟基异黄酮，它广泛存在于包括大豆在内的多种蔬菜和水果中［1］. 实验研究显示，染料木黄酮在乳腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等多种肿瘤的发生、发展中有多重抑瘤效应［2］，已成为国际抗癌药物的研究热点. 其主要防癌机制为调节雌激素受体、抑制细胞代谢关键酶活性、增加抗氧化酶的活性及抑制血管生成作用等［3-7］. 因而，染料木黄酮对肿瘤的化学预防及治疗作用受到人们的广泛关注. 卵巢癌是激素相关性肿瘤，是一种常见且恶性程度较高的妇科肿瘤. 本实验采用人卵巢粘液性囊腺癌细胞系3AO，研究染料木黄酮对该细胞系增殖和凋亡的影响，为其应用于卵巢癌的临床治疗提供实验依据.
1材料和方法
材料
细胞培养人卵巢粘液性囊腺癌细胞系3AO由第四军医大学西京医院妇产科实验室常规保存，用含100 mL/L新生牛血清(杭州四季青)的DMEM(美国Gibco)培养基培养细胞，于37℃，含50 mL/L CO2培养箱中培养传代，选用对数生长期细胞实验.
实验试剂染料木黄酮购于美国Sigma公司，纯度为98%，用分析天平称取染料木黄酮，用DMSO配成储备液，置于-20℃冷冻保存. 细胞给药前，用DMEM培养液稀释至所需浓度，并调整DMSO在各组培养液中的终浓度均为 mmo/L. TUNEL试剂盒购于德国Roche公司; 兔抗雌激素性β受体购于美国Chemicon公司;二抗,SP试剂盒及DAB试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司.
爬片制备对数生长期细胞接种于24孔板中进行爬片，培养24 h后细胞全部贴壁，实验分空白对照组和实验组(染料木黄酮终浓度为10 mg/L)，加入不同处理因素共孵育，于48 h收集爬片，PBS洗涤2次，950 mL/L乙醇固定爬片10 min，晾干备用.
方法
形态学观察倒置显微镜下动态观察培养瓶中卵巢癌细胞在用药前后的变化.
四唑盐(MTT)比色试验测定生长抑制率对数生长期3AO细胞以每孔1×103个细胞的密度接种于96孔培养板. 细胞贴壁培养24 h后，加入染料木黄酮共孵育进行MTT实验. 对照组只加培养液，DMSO溶剂对照组只加 mmol/L DMSO. 每组设6个复孔. 与实验组平行设只加培养液不加细胞的空白对照孔，比色时以此孔调零. 酶连免疫检测仪测定不同药物浓度及不同时间下的吸光度值A490 nm. 以每组6个孔A490 nm的平均值作为各组的平均A490 nm值. 记录结果，计算染料木黄酮对3AO细胞的抑制率：细胞生长抑制率(%)=×100 %. IC50表示半数抑制浓度.

透射电镜下观察细胞凋亡对数生长期细胞加入10 mg/L染料木黄酮共孵育，48 h消化收集细胞，PBS洗2次，离心后加入4℃预冷的40 g/L戊二醛固定，10 g/L锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制成超薄切片，透射电镜下观察.
法检测确定凋亡随机选取对照组和实验组爬片，严格按照说明书流程操作，水化、封闭、渗透，滴加TUNEL反应混合液，37℃暗湿环境中孵育60 min，漂洗，加ConventerPOD液37℃湿盒孵育30 min，DAB显色，光镜下观察. 细胞调亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片断，TNUEL可以有效地去探测DNA片段的产生. 因此其表达定位于胞核，阳性反应为核被染棕褐色. 随机取10个高倍镜视野进行阳性细胞计数，计算平均值.
流式细胞仪检测细胞周期，定量分析凋亡对数生长期细胞贴壁后，与浓度为5，10 mg/L的染料木黄酮共孵育，空白对照组不加药，分别于12，24，48 h离心收集细胞，PBS洗涤并制成单细胞悬液. ①PI单染色法检测细胞周期变化；②Annexin VFITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率.
免疫细胞化学法检测ERβ爬片依步骤处理后加入一抗，4℃过夜，次日滴加二抗， SP法染色，DAB显色，苏木精复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察.
统计学处理：采用统计软件SPSS 进行分析，试验数据均以x±s表示. 组间A490 nm比较用析因设计的方差分析，组间两两比较用SNK法. TUNEL法阳性细胞
　　计数，采用两样本均数t检验，差别有显着意义.
2结果
染料木黄酮对3AO细胞形态的影响倒置显微镜下可见，3AO细胞呈单层生长，细胞呈椭圆形或多角形，胞核圆形或椭圆形，胞质透亮. 经染料木黄酮处理后，细胞形状变窄，胞质透亮度下降，颗粒感增强，部分细胞胞突回缩变圆，脱落呈悬浮状，并见细胞碎片. 且这些变化随染料木黄酮剂量的增加和作用时间的延长而加重. 至72 h，细胞回缩成不规则圆形，可见大量细胞碎片. 电镜下可见细胞超微结构发生典型的凋亡形态学改变.
染料木黄酮对3AO细胞生长的抑制作用MTT试验表明染料木黄酮对3AO细胞的抑制作用随浓度的升高和用药时间延长而增强，经计算IC50为10 mg/L，药物浓度与作用时间之间有交互作用.
法检测确定凋亡光镜下，10 mg/L染料木黄酮作用48 h后，出现大量阳性凋亡细胞，核深染，成斑点状或斑块状；而对照组细胞核几乎无着色. 加药组阳性细胞数量平均为±，而对照组中阳性细胞数量仅为±，二者差异显着.表1MTT法检测染料木黄酮对3AO细胞增值的影响对照和各浓度各时间点组间比较； vs对照和各时间点组间比较.
染料木黄酮对3AO细胞周期和凋亡率的影响流式细胞仪结果显示，和对照组相比，染料木黄酮处理的3AO细胞出现细胞周期中G2/M期细胞显着增多，S期细胞显着减少，表现出G2/M期阻滞；此外，10 mg/L染料木黄酮给药48 h在G0/G1前出现典型亚二倍体凋亡峰. 与对照组相比，5 mg/L与10 mg/L染料木黄酮作用12，24，48 h后抑制率两两之间均差异显着，药物处理不同时间各组间抑制率亦均有显着差异. 表明染料木黄酮诱导3AO细胞凋亡随浓度增高和时间延长而增强，其中10 mg/L染料木黄酮作用48 h后抑制率达%. 卵巢癌中，ERβ蛋白表达定位于胞核，阳性反应为核深染成深棕色. 光镜下可见染料木黄酮作用后，ERβ表达明显增强.
3讨论
本实验采用了多种检测细胞增殖活性及凋亡的方法，检测了染料木黄酮对3AO细胞凋亡作用的量效和时效关系，较肯定地证明了一定浓度的染料木黄A: 对照酮可诱导3AO细胞凋亡，抑制其增殖. MTT试验中，随着染料木黄酮浓度的升高，3AO细胞的生长均受到不同程度的抑制. 当剂量达10 mg/L和20 mg/L时，抑制作用明显，表明染料木黄酮对3AO细胞的抑制作用随浓度的升高和用药时间延长而增强. 作为一种植物雌激素，染料木黄酮结构与17β雌二醇相似［8］，可与雌激素受体(ER)结合，结合后的潜在健康效应表现为U型剂量效应关系，表现为类雌激素活性和抗雌激素活性. 染料木黄酮的雌激素作用和抗雌激素作用，取决于剂量及机体甾体雌激素状态，具有双向调节平衡功能. 此结论与李昱等结论不同［9］.
实验中观察到染料木黄酮作用于3AO细胞系后，诱导卵巢癌细胞发生凋亡，从而抑制细胞生长. 倒置显微镜下可见酷似凋亡的细胞，电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变. TUNEL法更直观地观察到大量阳性凋亡细胞.
卵巢癌是性激素依赖性肿瘤，雌激素有利于卵巢癌的发生，雌激素通过与ERα，ERβ的同二聚体及异二聚体结合发挥生物学作用. Rutherford等［10］发现，在卵巢癌中，ERα/ERβ mRNA的比率升高，ERα相对于ERβ的过表达是卵巢癌发生的标志，而此结果系ERβ表达下调所致. 本实验免疫细胞化学结果显示：染料木黄酮作用后，ERβ表达明显加强. 说明染料木黄酮作为一种植物雌激素，当达到一定浓度时，与雌激素竞争性与ERβ结合，表现为抗雌激素活性，从而诱导卵巢癌细胞发生凋亡，发挥抗肿瘤作用. 因此染料木黄酮可能通过ERβ途径发挥药理作用. 并且，染料木黄酮可能独立的通过雌激素受体途径抑制细胞增殖和因子的表达. 我们的发现揭示了染料木黄酮化学预防卵巢癌的可能机制，且染料木黄酮几乎无毒性［11］，为染料木黄酮临床治疗卵巢癌提供一定的实验依据.
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