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吉西他滨对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响
【摘要】 目的 研究吉西他滨体外对人非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的作用。方法 应用MTT法，流式细胞仪，Annexin VPI双标法， Tunel法等多项方法，体外研究吉西他滨对A549细胞的促凋亡作用；采用免疫组化的方法，观察药物作用后bcl2表达的变化。结果 吉西他滨对A549细胞生长具有抑制作用，并有促凋亡效应，对细胞周期的影响表现为S期的阻滞，药物处理的细胞凋亡，可见伴有bcl2的下调。结论 吉西他滨可抑制人非小细胞肺癌A549细胞的生长，并诱导细胞发生凋亡，其诱导凋亡是吉西他滨抗肿瘤作用机制的原因之一，而且凋亡与bcl2的表达有一定关系。
【关键词】 吉西他滨 细胞凋亡 非小细胞肺癌 bcl2
　　0 引言

　　非小细胞肺癌的预后比较差，尽管现在的治疗不断发展，生存率提高的还是很少[1]。凋亡受阻是肿瘤发生的主要原因,诱导肿瘤细胞分化和凋亡已成为当前肿瘤治疗的热点。吉西他滨是一种新型的脱氧胞苷类似物和核苷还原酶抑制剂，对多种实体瘤具有良好的抗肿瘤活性。但是体外研究其对非小细胞肺癌的凋亡作用及其凋亡机制的研究尚且不多。
　　1 材料和方法
　　药物与试剂

　　吉西他滨，RPMI1640培养基，小牛血清为Gibico公司产品，bcl2单克隆抗体购于北京晶美公司，HEPES，四氮唑蓝、二甲基亚砜，碘化丙啶，免疫组化试剂盒，AnnexinVPI双标凋亡试剂盒均为北京中山生物公司产品。
　　细胞培养

　　人肺腺癌细胞A549由同济医院呼吸内科重点实验室冻存。细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液在5% CO2, 37℃，饱和湿度的细胞培养箱培养, 细胞呈贴壁生长,用%的胰酶和% EDTA(1∶1)消化传代，用于实验的细胞均处于指数生长期。
　　细胞体外生长活性的检测

　　取指数生长期的培养细胞,用%胰蛋白酶消化，以1×104/孔的密度接种于96孔板，每孔设3个复孔，以不含细胞的培养液做空白对照。贴壁后，加入不同浓度的吉西他滨,按常规方法操作后，用酶联免疫仪测490nm处的吸光度值。
　　流式细胞仪分析细胞周期

　　各组药物处理细胞72h后，进行细胞消化，收集所有悬浮细胞。调整细胞密度为5×105 ～1×106个/ml,取1ml细胞，1 000r/min离心5min，去培养基。细胞收集后，加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定过夜,PBS洗两遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶和1mg/mlRNase A,室温避光染色30min后上机检测。
　　AnnexinVPI双标记法分析细胞凋亡率

　　如上法收集药物处理72h后的细胞，按试剂盒操作说明书操作后，上流式细胞仪检测。采用CELIQUEST软件分析早期细胞凋亡率。
　　TUNEL法

　　制作不同浓度不同时间作用后的细胞爬片,按试剂盒操作说明书操作。
　　bcl2癌基因产物表达检测

　　将各实验组和对照组在不同药物浓度下分别培养24h,48h,72h后，制成盖玻片培养细胞标本，按SP试剂盒说明书操作，用图像分析仪进行分析。
　　统计学分析

　　数据以 ±s 表示，用t检验分析差异显着性，采用Pearson相关分析进行相关检验，运用统计软件分析数据。
　　2 结果
　　吉西他滨对A549细胞生长增殖能力的影响

　　吉西他滨不同浓度对细胞的抑制率可按公式计算:肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%,可见各浓度组对A549细胞均有抑制作用，呈时间、剂量依赖性，差异有显着性(），见图1。
　　图1 吉西他滨对人小细胞肺癌细胞A549生长抑制作用

　　吉西他滨对A549细胞周期的影响

　　在药物作用72h， 随着药物浓度的增加， G0/G1期细胞比例不断增高， 处于S期细胞比例降低， 对细胞周期有明显影响， 将细胞阻滞与G0/G1期， 见表1。
　　表1 不同浓度吉西他滨对A549细胞周期的影响
　　Annexin VPI 联合双染测凋亡率

　　结果显示，作用72h后，各浓度吉西他滨处理的细胞的凋亡率分别为(±)%、(±)±)%、(±)%、(±)%、(±)%相关性分析显示药物浓度与凋亡发生呈正相关，即随着药物浓度增加细胞凋亡增加。
　　TUNEL检测

　　阴性组仅见蓝灰色的凋亡阴性染色吉西他滨处理各浓度组可见核呈深棕黄着色的凋亡细胞呈小片或散在分布,细胞核碎裂、大小不一，提示处理后细胞发生特征性凋亡生化改变，见图2。
　　bcl2的表达

　　通过免疫组化方法， DAB染色后，各组细胞浆中均可见颗粒样分布深浅不一的棕黄色物质。通过药物处理前后细胞棕黄色物质的平均吸光度分析， 经两样本均数比较的ｔ检验进行比较, Ｐ0. 001, 按α=0. 05标准, 说明吉西他滨处理后bcl2的表达下调具有显着性差别。 通过相关性分析， 发现其表达与其凋亡率成负相关，见图3。
　　3 讨论

　　吉西他滨是一种药物前体，在细胞内转变成磷酸化代谢物,才能发挥细胞毒作用。吉西他滨的药物敏感性与体内脱氧胞苷激酶水平有着正相关的关系[35]。吉西他滨被细胞摄入后,转变为活性代谢物吉西他滨二磷酸酯或三磷酸酯，竞争性抑制DNA链的延长,导致DNA片段形成和细胞死亡。

　　我们研究了吉西他滨对于A549细胞增殖和凋亡的影响。MTT法示各浓度组对A549细胞增殖均有抑制作用，呈时间、剂量依赖性。通过PI染色的流式细胞测得细胞周期，如其药理学特性，主要作用于Ｓ期, 使细胞停滞于 S期，对Ｇ2和Ｍ期无明显作用[7,8]。通过双标法，测得细胞的凋亡率为、%、%、%、%、%。

　　其诱导肿瘤细胞凋亡的机理和途径目前尚未完全明了，有研究报道Fas/FasL信号通道不介导吉西他滨诱导细胞凋亡。Chalfant 等人研究发现吉西他滨诱导细胞凋亡与神经酰胺途径有关，通过激活内源性神经酰胺，触发Caspase3的激活，诱导caspase9和bclx的剪接变化。其介导的凋亡可被过表达的bcl2 所抑制[10]。而bcl2介导的途径是否参与吉西他滨诱导的凋亡目前国内外尚无明确的研究。bcl2蛋白过表达会提高细胞的存活率,相反将促进细胞凋亡。免疫组化方法染色后，采用t检验分析药物作用前后两者吸光度值，发现吉西他滨作用后，bcl2的表达下调，并通过相关分析得出其表达与其凋亡率为负相关。其表达下调可能通过阻断Ｃａ２+, 维持滑面内质网钙稳态,阻止凋亡的发生，也可能通过抑制Caspase3的激活,阻断生理性或病理性刺激对细胞凋亡的诱导。

　　综上所述，本研究表明吉西他滨可显着地抑制非小细胞肺癌A549细胞的体外增殖，其机理可能与干扰细胞周期诱导，诱导细胞凋亡有关， bcl2在此凋亡过程中有一定的作用。但其具体内在机制目前尚不明了，还需要我们进一步研究和讨论。
　　【参考文献】
　　［1］ Mortenson MM,Schlieman MG,Virudachalam S,et　of the proteasome inhibitor bortezomib alone and in combination with chemotherapy in the A549 nonsmallcell lung cancer cell line[J]. Cancer Chemother Pharmacol， 2004, 54(4):343353.
　　Dong M, Lin C, Feng FY, et al. Development and characterization of a gemcitabineresistant variant of human lung adenocarcinoma cell line A549[J]. Ai Zheng， 2004,23(6):667671.
　　Beausejour CM, Gagnon J, Primeau M, et　activitity of 2‘, 2‘difluorodeoxycytidine, 5aza2‘deoxycytidine and cytosine arabinoside in cells transduced with deoxycytidine kinase gene Biochem Biophys Res Commun[J]. 2002293(5):14781484．
　　Giovannetti E，Mey V,Danesi R, et al. Interaction between gemcitabine and topotecan in human nonsmallcell lung cancer cells: effects on cell survival, cell cycle and pharmacogenetic profile[J]. Br J Cancer， 2005,92(4):681689．
　　Kroep JR, Loves WJ,Vander Wilt CL, et al. Pretreatment Deoxycytidine Kinase Levels Predict in Vivo Gemcitabine Sensitivity[J]. Molecular Cancer Therapeutics， 2002,1(6):371376.
　　尤长宣,罗荣城. 治疗非小细胞肺癌的新药吉西他滨［J］. 国外医学肿瘤学分册, 2000,27(5):309311．
　　John L Tonkinson, John F Worzalla, ChiHse Teng，et al. Cell Cycle Modulation by a Multitargeted Antifolate, LY231514, Increases the Cytotoxicity and Antitumor Activity of Gemcitabine in HT29 Colon Carcinoma[J]. Cancer Research 1999, 59(15):36713676．
　　Serrano MJ,SanchezRovira P, Alagarra I,et al. Evaluation of a gemcitabinedoxorubicinpaclitaxel combination schedule through flow cytometry assessment of apoptosis extent induced in human breast cancer cell lines[J]. Cancer Research， 2002,93(5):559566.
　　RJ Bold, J Chandra, DJ McConkey, et al. Gemcitabineinduced programmed cell death (apoptosis) of human pancreatic carcinoma is determined by Bcl2 content[J]. Annals of Surgical Oncology, 1999,6(3):279285．
　　[10]Lee SJ, Ko WG, Kim JH, et　of apoptosis by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin via cytochrome cmediated activation of caspase3 protease[J]. Biochem Pharmacol， 2000,60(5):677685．