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CQ11逆转多药耐药人胃癌细胞株对多柔比星的耐药
【摘要】 目的: 探讨氯喹衍生物CQ11对耐长春新碱(vincristine, VCR)人胃癌多药耐药(multidrug resistance, MDR) 细胞株SGC7901/VCR的耐药逆转作用。 方法：将SGC7901和SGC7901/VCR细胞分别与各种浓度的多柔比星(doxorubicin, DOX)和/或CQ11在体外共同培养，采用MTT法检测其细胞毒作用；采用荧光分光光度计测定细胞内DOX蓄积量。结果：SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药程度是SGC7901细胞的倍。、 和　mol/L的CQ11分别使DOX对SGC7901/VCR细胞的敏感性分别增加到倍()、倍() 和14倍(P )。DOX蓄积实验表明，CQ11能显着增加SGC7901/VCR细胞内DOX蓄积，而对SGC7901细胞内DOX蓄积无明显影响。结论：通过增加细胞内DOX蓄积量，CQ11在体外能有效逆转SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药性
【关键词】 多药耐药; 氯喹; 胃癌; 逆转剂
肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机理各异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性［1］。MDR是一种独特的广谱耐药现象，是导致化疗失败的重要原因，许多天然来源的抗肿瘤药物如长春新碱(vincristine, VCR)、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如多柔比星(doxorubicin, DOX)、柔红霉素都极易发生MDR［1~3］。MDR主要的耐药机理为多药耐药基因mdr1扩增及其蛋白产物P-糖蛋白(permeability glycoprotein, Pgp)过表达。作为一个ATP依赖性的药物转运泵，Pgp能主动将疏水性抗肿瘤药物泵出胞外, 从而减少细胞内药物蓄积, 增加药物外排［3］。MDR逆转剂，如维拉帕米和环孢菌素A，能与Pgp结合，抑制Pgp的药物外排功能，增加耐药细胞内抗肿瘤药蓄积，从而恢复细胞对抗肿瘤药的敏感性。然而，大量的临床研究结果表明，上述肿瘤MDR逆转剂由于体内毒性大，体内难以达到有效逆转浓度［3］。 因此积极寻找高效低毒的新型MDR逆转剂，已成为肿瘤MDR研究的热点。
氯喹 CQ11
图1 氯喹和氯喹衍生物CQ11的化学结构
CQ11是以抗疟药氯喹的结构母核为基础, 经侧链改造而获得的新化合物(化学结构见图1)， 由本课题组合成。本研究以耐VCR人胃癌MDR细胞株SGC7901/VCR为体外模型， 研究CQ11对SGC7901/VCR细胞的体外MDR逆转效应。
1 材料与方法
　药物和试剂
CQ11由本课题组自行合成, 以二甲亚砜(dimethylsulfoxide , DMSO) 溶解。MTT和DOX购自Sigma公司。
　细胞培养
SGC7901细胞和SGC7901/VCR细胞均由本室保存［4］，细胞均用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5% CO2孵箱中培养。 SGC7901/VCR在含 mol/L VCR培养液中稳定生长, 在正式实验前2周撤去VCR。
　细胞存活率测定
采用MTT法测定细胞毒作用［4］。取生长旺盛SGC7901和SGC7901/VCR细胞，稀释后接种于96孔平底培养板中，置CO2培养箱中培养。 接种24 h 后分别加入不同浓度的DOX 和/或 CQ11，使液体总量达到每孔200μL; 继续培养72 h，弃去培养液，每孔加MTT10μL ( g/L in PBS), 培养4 h, 弃去MTT，每孔加DMSO 150μL, 在微孔板震荡器上振荡10 min, 成色产物溶解后用酶标仪测570 nm处吸光度值。以不加药的瘤细胞组为对照，求给药组IC50，并计算耐药逆转倍数(reversal fold, RF)。
　细胞内DOX蓄积实验
DOX蓄积实验参照我们以往的报道进行［2］。简述取生长旺盛的SGC7901 或SGC7901/VCR细胞, 调节其浓度至×106/mL, 加入DOX　μmol/L和不同浓度的CQ11 (分别为 , , , , ,　和 10 μmol/L) , 在37℃、5% CO2 孵箱中培养60 min, 取上述溶液 mL, 100×g 离心5 min, 冷PBS 洗2次, 加入 mL 50%乙醇- mol/L盐酸溶液, 抽提2 h, 100×g离心10 min, 收集上清, 在荧光分光光度计上测DOX的荧光强度(激发波长和发射波长分别为488 nm和590 nm)。 在盐酸-乙醇溶液中加入一系列已知浓度的DOX作为标准溶液, 分别测定其荧光强度, 建立DOX浓度-荧光强度标准曲线。
　统计学处理
实验数据以均数±标准差表示，显着性检验采用Student‘s t 检验， P 被认为差异有统计学意义。
　　2 结果
　CQ11的细胞毒作用
CQ11对SGC7901和SGC7901/VCR细胞的IC50分别是32±μmol/L和34±μmol/L, 10μmol/L CQ11对SGC7901和SGC7901/VCR细胞无细胞毒作用。
　CQ11对SGC7901/VCR 细胞的耐药逆转效应
如表 1 所示，SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药程度是SGC7901细胞的倍。对SGC7901/VCR 细胞, CQ11具有显着的耐药逆转作用;　μmol/L CQ11即具有明显的耐药逆转效应,　μmol/L CQ11使DOX对SGC7901/VCR细胞IC50从 ±μmol/L降低到± mol/L (耐药逆转倍数为14倍)，显示CQ11对SGC7901/VCR 细胞的MDR具有显着的逆转作用;　μmol/L CQ11使DOX对SGC7901细胞IC50从±μmol/L降低到± mol/L (增敏倍数为倍), 表明在SGC7901细胞CQ11 有轻度的DOX增敏作用。表1 CQ11增强DOX对SGC7901/VCR和SGC7901注：与未加CQ11的SGC7901细胞比较，*; 与未加CQ11的SGC7901/VCR细胞比较，# 。
　CQ11对细胞内DOX蓄积的影响
DOX 蓄积实验显示, SGC7901细胞DOX蓄积量是SGC7901/VCR 细胞的倍。加用10 μmol/L CQ11时，SGC7901细胞DOX蓄积量无明显影响。CQ11能剂量依赖性地增加SGC7901/VCR细胞内DOX蓄积量：加用、、和10 μmol/L的CQ11，分别使 SGC7901/VCR 细胞内DOX蓄积量增加到倍、倍、倍和倍。
与未加CQ11的SGC7901细胞比较, * ; 与未加CQ11的SGC7901/VCR 细胞比较, #
图2 不同浓度的CQ11对SGC7901和SGC7901/VCR 细胞内DOX 蓄积的影响
3 讨论
药物构效关系研究发现，MDR逆转剂具有一些共同的结构特征：① 具有多个芳香环结构；② 具有叔氮原子，且与芳香环的距离要两个碳原子以上；③必须具有亲脂性［5］。依据这些研究成果，对现有的逆转剂进行结构改造，以寻找高效低毒的逆转剂，已成为目前MDR逆转剂研究的重要方向。
早在上世纪80年代末体外研究已经发现氯喹、奎宁和奎尼丁等抗疟药在体外能够与Pgp结合并部分逆转肿瘤耐药［6］。本研究以抗疟药氯喹的结构母核为基础合成了21种氯喹衍生物，以SGC7901/VCR为体外细胞模型，采用MTT方法测定氯喹衍生物和DOX作用下SGC7901/VCR细胞的存活率, 发现其中5种衍生物具有不同程度的肿瘤MDR逆转作用，而CQ11是MDR逆转作用最强的氯喹衍生物。
SGC7901/VCR细胞是采用递增DOX浓度的方法，将SGC7901细胞在含浓度不断递增的DOX的培养基中连续培养所获得的耐药细胞株［4］。多个独立研究小组的研究结果报告均表明，SGC7901/VCR细胞是典型的过表达Pgp的肿瘤MDR细胞株，对DOX表现交叉耐药，已被作为体外细胞模型成功地用于肿瘤MDR逆转实验［4,7~8］。
本研究结果显示，SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药程度是SGC7901细胞的倍；、 和　mol/L的CQ11使DOX对SGC7901/VCR细胞的敏感性分别增加到倍、倍和14倍。DOX蓄积实验显示， mol/L CQ11能使SGC7901/VCR细胞内DOX蓄积量恢复到接近SGC7901细胞水平，提示CQ11能抑制Pgp的DOX外排功能。上述结果表明，CQ11能通过抑制Pgp的DOX外排功能、增加SGC7901/VCR细胞内DOX蓄积量，逆转SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药性。更重要的是， μmol/L CQ11对SGC7901/VCR细胞的MDR即产生明显的耐药逆转效应，而 10μmol/L的CQ11对SGC7901和SGC7901/VCR细胞没有明显的直接细胞毒作用。
总之，我们的研究表明，通过抑制Pgp介导的药物外排，增加细胞内DOX蓄积量，非细胞毒剂量的氯喹衍生物CQ11在体外能有效逆转SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药性，提示CQ11是一个有开发前途的多药耐药逆转剂。下一步作者将深入研究CQ11逆转MDR的作用机制。
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