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浅论小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响
【摘要】 目的 研究不同浓度的小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响。方法 采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液，以低血清进行肝细胞原代培养，12～16 h后用 mmol/L的H2O2诱导肝细胞损伤，同时加以不同浓度的肝提取物，观察(100～1 000)mg/L的小牛肝提取物对肝细胞损伤的影响。结果 小牛肝提取物在100 mg/L时即可起到保护肝细胞损伤的作用，但效果不明显，在500 mg/L时可明显保护肝细胞损伤，之后随着浓度的加大保护作用逐渐减弱。结论 小牛肝提取物对H2O2诱导的肝细胞损伤具有一定的保护作用，其中以浓度为500 mg/L时效果最明显。
【关键词】 小牛肝提取物 H2O2 肝细胞培养 肝细胞损伤 保护作用
　　Abstract：Objective To study the effect of different concentrations of calf liver extract on the damage of the neonatal mice hepatocytes. Methods Hepatocytes were digested by IV-Collagenase and cultured with low-serum medium, induced by H2O2 after 12～16 h. Various concentrations of calf liver extract were added to the primary cultured hepatocytes to observe the effect of (100～1 000) mg/L calf liver extract on the injured liver cell. Results Calf liver extract at 100 mg/L could protect the hepatocytes from injury, but the effect was not obvious. At 500 mg/L, calf liver extract could protect the hepatocytes obviously. With increasing concentration, the protective effect weakened gradually. Conclusions Calf liver extract could protect hepatocytes from damage induced by H2O2, the effect at a concentration of 500 mg/L was the most obvious.
Key words：calf liver extract; H2O2; hepatocytes culture; hepatocytes injured; protective effect
小牛肝提取物以小牛肝为主要原料,经物理方法提取的小分子蛋白质，含有丰富的维生素B2、B12、叶酸、肝细胞刺激因子、嘌呤核苷和各种氨基酸，整体实验已证实对急性肝损伤具有保护作用［1］。为进一步研究肝提取物的保肝作用，本文采用Ⅳ型胶原酶消化法分离肝细胞进行体外培养，用H2O2体外诱导肝细胞氧化损伤模型，在细胞水平上证实小牛肝提取物对肝细胞损伤的保护作用，为生物药的研发和应用提供可靠依据。
1 材 料
　　实验动物
　　昆明株1～3 d新生小鼠，雌雄不限
　　药品与试剂
　　小牛肝提取物；D-Hanks液；Ⅳ型胶原酶；RPMI-1640；青霉素100 μg/mL，链霉素100 μg/mL；H2O2、胎牛血清；细胞培养板；MTT试剂盒、ALT试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒
2 方 法
　　小牛肝提取物的制备
　　取1 kg小牛肝，按文献［2］的方法制备提取物。提取物呈微黄色粘稠状液体，味腥；照分光光度法测定，在285 nm 的波长处有最大吸收；pH值应为～；-20 ℃保存。
　　新生小鼠肝细胞的分离与培养
按文献［3］ ，将乳鼠于75%酒精中浸洗10 s后断头处死，迅速取出肝脏置于含有双抗的4 ℃的D-Hnaks液中漂洗去除血污，剥除被膜和血管等纤维成份，用剪刀将肝组织剪成1 mm3左右的小块，再倒入4 ℃D-Hanks液试管中，吸管吹打，待组织沉淀后吸出上清，如此反复3次后，加入%Ⅳ型胶原酶，4 ℃冰箱放置6～7 h。消化完全者可用吸管吹打散开，悬液经200目尼龙网过滤,得到悬液中加入含10%胎牛血清的完全培养基，于4 ℃冰箱中静置30 min，多数上皮细胞沉于管底，而血细胞及碎片仍多浮于悬液中，弃悬液，加入RPMI-1640培养基，以1 000 r/min离心4 min，反复3次，最后加入含10%胎牛血清的完全培养基，以1×106 cell/mL接种于培养板10 h后首次换液，换以5%胎牛血清的培养基，36 h后再次换液，并降低胎牛血清含量至1%，培养48 h后，采用无血清培养。
　　肝提取物对H2O2诱导肝细胞损伤的影响
按文献［4］，取上述原代培养48 h肝细胞，设正常对照组、H2O2损伤模型组、肝提取物(100，500，700，1 000 mg/L)［2］2254个剂量保护组。模型组和保护组加入H2O2　mmol/L［5］，同时保护组加入不同浓度的肝提取物，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养2 h，收集96孔板中培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞测定MDA含量和SOD活力，MTT比色法测定96孔板中肝细胞的存活率。
　　肝细胞存活率的测定
采用MTT比色法。使用96孔细胞培养板常规培养，施加处理因素，加入终浓度为5 g/L MTT液20 μL/孔37 ℃孵育4 h。终止培养前，轻轻吸弃上清培养液，之后加入DMSO 150 μL/孔，均匀振荡15 min使结晶完全溶解，以DMSO为空白调零，测定570 nm波长处各组各孔的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。并按公式：细胞存活率＝× 100%计算细胞存活比例。
　　ALT的测定　
采用赖氏法。各组分别取大鼠肝细胞上清样本1 mL于EP管内 ，按照试剂盒说明书步骤操作。505 nm波长，蒸馏水调零，测定吸光度，测定管吸光度减去对照管吸光度之差，查标准曲线，求得相应的值ALT/GPT活力单位进行计算。以U/mL表示结果。
　　MDA含量的测定
常规培养，加处理因素，按照试剂盒说明书进行操作，取上清使用分光光度计比色，测定吸光度。按以下公式计算MAD含量：MDA含量＝［/］ ×标准品浓度×测试前稀释倍数(其中标准品浓度为10 nmol/mL)。肝细胞MDA含量的结果以nmol/mL表示。
　　SOD活性测定
常规培养，加处理因素。根据SOD对超氧阴离子自由基有专一抑制作用的原理，使超氧阴离子自由基氧化羟胺形成亚硝酸盐减少，吸光度值降低。按试剂盒说明书进行操作，加入样品和各种试剂，混匀，37 ℃恒温水浴40 min，加入显色剂后混匀，室温放置10 min，使用分光光度计比色，测定吸光度。按以下公式计算SOD活力
SOD活力＝［(对照管吸光度－测定管吸光度)/对照管吸光度］÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。
　　统计学处理
各组实验数以均数±标准差表示，数据处理应用软件完成，采用方差分析及q检验进行统计分析。 认为结果有差异； 认为结果有显着性差异。
3 结果
　　肝提取物对肝细胞存活率的影响
H2O2作用肝细胞2 h后，模型组肝细胞损伤明显，细胞存活率显着下降，大量肝细胞发生坏死，加入100 mg/L的肝提取物，细胞存活率上升，且随着剂量的增加活性增大，500 mg/L时达到最大，之后随着肝提取物剂量的增加细胞存活率与正常组比较上升逐渐不明显(表1)。表1 肝提取物对损伤细胞存活率的影响注：a与正常组比较；b与H2O2组比较
　　肝提取物对损伤肝细胞ALT活力的影响
H2O2作用肝细胞2 h后，转氨酶释放量明显升高，肝提取物保护组在剂量为100～500 mg/L时，转氨酶活力随着剂量的增加而下降，在剂量大于500 mg/L时，随着剂量的增加转氨酶活力下降的幅度逐渐减小，在1 000 mg/L时与H2O2损伤组比较无差异。表2 肝提取物对H2O2损伤组ALT活力的影响注：a与正常组比较 ；b与H2O2损伤组比较；c与H2O2损伤组比较；d与H2O2损伤组比较
　　肝提取物对损伤肝细胞MDA生成量的影响
施加处理因素2 h后，H2O2损伤组MDA生成量明显高于正常组。在药物保护各组，随着药物剂量的变化，各组与H2O2损伤组相比，MDA含量明显降低，剂量达到一定浓度时，保护作用最好，之后细胞MDA含量不再随浓度的改变而降低。表3 肝提取物对H2O2损伤组MDA生成量的影响注：a与正常组比较 ；b与H2O2损伤组比较
　　肝提取物对损伤细胞SOD活性的影响
施加处理2 h后，H2O2损伤组SOD活力明显低于正常对照组。在药物保护各组，剂量达到一定浓度，SOD活力明显高于H2O2损伤组，其中在500～700 mg/L达到最大活力范围，之后有下降趋势。表4 肝提取物对损伤细胞SOD活力的影响 注：a与正常组比较；b与H2O2损伤组比较
4 讨论
氧化应激是多种因素(药物、毒物、乙醇等)引起的肝细胞损伤的共同损伤机制［6,7］。肝细胞受到氧化损伤时，自由基及其过氧化反应产物破坏细胞膜和细胞结构，使细胞清除自由基能力下降，膜通透性升高，肝细胞内ALT，AST等酶外逸，导致细胞肿胀坏死［8］。H2O2是一种重要的活性氧，它的大量产生不但直接损伤肝细胞，而且可转变为OH·，攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，导致肝细胞损伤［9］。本文采用原代培养新生小鼠肝细胞，以H2O2诱导肝细胞氧化损伤模型，并加入不同浓度的小牛肝提取物进行保护，通过测定细胞存活率、上清液中ALT活性、肝细胞MDA含量及SOD活力作为判断肝细胞损伤和小牛肝提取物保护作用的检测指标。结果显示，H2O2可明显使肝细胞存活率降低，ALT活性升高，MDA含量增多，SOD活力降低。给予保护后可见，小牛肝提取物可直接改善H2O2诱导的肝细胞损伤，使升高的ALT、AST活性明显降低，并明显改善受抑的肝细胞增殖和减少肝细胞坏死；还可明显降低由H2O2引起的肝细胞MDA含量的增多，并升高SOD活力，因而减轻膜脂质过氧化。结果证实了小牛肝提取物可拮抗自由基引起的脂质过氧化反应，保护肝细胞结构和功能的完整性，避免肝细胞遭受各种氧化损伤。
【参考文献】
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