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小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
【摘要】 目的 建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法 改良酶消化法。结果 用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。结论 与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得 小鼠 动脉血管平滑肌细胞 原代培养
Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.
Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult
在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法，从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
1 材料与试剂
1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。
1．2 试剂： 鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。
1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％ 胎牛血清、１％青霉素、 链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用。
1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)， 过滤除菌即用。
1．5 ７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。
1．6 器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜，荧光显微镜(LEICA DMI6000B）。
2 方法
2．1 常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部, 打开胸、腹腔 , 暴露心脏。
2．2 ５ mL 注射器穿刺左心室， PBS 缓冲液冲洗主动脉。
2．3 完整分离主动脉，放入100 mm无菌平皿，滴1～2滴PBS 缓冲液。
2．4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明。
2．5 取出血管，放入另一有 PBS 缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。
2．6 眼科剪将血管快速剪成１～２ mm2 大小后用胶原酶消化３～４ h。
2．7 加入 DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1 ml 新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。
2．8 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。
　　3 细胞鉴定
免疫荧光法鉴定平滑肌细胞：常规消化，细胞接种于培养载玻片。第2天用PBS 缓冲液轻缓洗涤，加％福尔马林液在室温下固定30 min后用PBS 缓冲液洗涤３次，２ min／次。然后用 ％ Triton-x-100 (PBS配制) 室温下渗透细胞10 min，以便抗体更好的进入细胞。用10％山羊血清(PBS配制) 封闭非特异性抗原30 min，鼠抗SMCα-actin 室温下孵育细胞２ h，PBS 缓冲液洗涤３次，５ min／次。以下步骤避光：用荧光标记二抗在室温下孵育细胞１ h，PBS 缓冲液洗涤３次，５ min／次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测。
4 结果
细胞于第2天游离出，第3天沿细胞团成放射状生长，成梭形，传代后细胞生长较快， 成典型的峰谷样生长， 细胞形态多呈宽大的长梭形， 核大一只小鼠的主动脉用该法培养，１０天左右即可获得１０6个细胞，传代生长快，可满足任何细胞试验要求。流式细胞仪检测细胞纯度达98%以上，免疫荧光检测显示细胞 SMC-α-actin 染色呈阳性， 绿色荧光呈束状，显示肌丝特征。
5 讨论
传统的原代培养方法［１,２］有两种， 一种是酶消化法，将组织用合适的酶消化后培养，因除去了妨碍细胞生长的间质，所以产量高，但因步骤繁琐，易发生污染且材料消耗较多，只适合培养大块组织。另一种是组织块培养法， 将组织活体取出后剪切成小块，贴于瓶壁等待细胞从组织四周游离出，该法细胞生长较慢且不一定每块都长出细胞，所以成功率不高, 但适合组织量少的细胞培养。目前国内平滑肌细胞的原代培养多采用组织块贴壁法［３～６］，因而也存在上述弊端。如何简化操作、提高细胞培养的成功率？在试验中我们反复比较，发现在传统的酶消化方法上进行改良可获得很好的效果，从而建立了上述改良的血管平滑肌细胞原代培养技术该方法将以往复杂的酶消化过程简化，大大减少了组织损失及污染机会，并简化了血管分离技术，使操作容易掌握，可重复性强，并且所培养的细胞活力强、生长快。在试验过程中，我们发现如注意以下几点可大大提高培养成功率：第一，要强调无菌观念，所用器械要高压消毒，打开胸、腹腔时所用的剪刀和镊子不再重复使用 ，其他器械在使用中要不断浸到70%乙醇中消毒灭菌，这样做基本可避免污染。第二，选用鼠龄８ W以上完全成年的小鼠。第三 ，使用解剖显微镜去除外膜，由于视野放大更能完整干净的去掉血管外膜。第四，小鼠动脉细小而薄，内膜无须刮除 。第五，掌握好消化时间，如果用新鲜的胶原酶，消化３ h或略长即可，太长的时间可致细胞活力丧失。第六，在最初两天尽可能不要动细胞，以免干扰细胞贴壁。
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