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叶下珠复方Ⅱ号体内抗鸭乙肝病毒的实验研究
【摘要】 　　【目的】观察叶下珠复方Ⅱ号体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法筛选DHBVDNA阳性的先天感染鸭30只，随机分为5组：病毒对照组,叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(剂量分别为336、186、84 g·kg-1·d-1)、拉米夫定组(剂量为20 mg·kg-1·d-1)。各组于用药前后分别采用荧光定量PCR法检测血清DHBVDNA含量变化。【结果】在给药第7、14、21、28天及停药后第5天叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组鸭血清DHBVDNA含量显着降低,与给药前和病毒对照组比较差异均有显着性意义(P＜005或P＜001)。【结论】叶下珠复方Ⅱ号具有一定的抑制DHBV复制作用。
【关键词】 叶下珠复方Ⅱ号/药理学 乙型肝炎,慢性/中药疗法 乙型肝炎病毒/血液 病毒复制疾病模型,动物；鸭
　　Abstract: ObjectiveTo evaluate the invivo effect of Compound Phyllanthus urinaria Ⅱ(CPU Ⅱ) on duck hepatitis B virus (DHBV).MethodsThirty ducks with congenital infection of DHBV, which were DHBVDNA positive confirmed by polymerase chain reaction (PCR), were randomly divided into 5 groups: DHBV control group, high, middle, and lowdosage CPU Ⅱgroups(in the dose of 336, 186 and 84 g-1·d-1, respectively), and Lamivudine group(20 mg·kg-1·d-1). The serum DHBVDNA level of all ducks was detected by quantity realtime fluorescence PCR before and after medication. ResultsOn the 7th, 14th, 21st, and 28th day of medication and on the 5th day of suspension of medication, the serum DHBVDNA level in both of the high and middledosage CPU Ⅱ groups was obviously lower than that before medication and than that in the DHBV control group (P＜005 or P001). ConclusionCPU Ⅱ has certain inhibitory effect on DHBV replication．
　　Key words:COMPOUND PHYLLANTHUS URINARIA Ⅱ/pharmacology;HEPATITIS B, CHRONIC/TCD therapy;HEPATITIS B VIRUS, DUCK/blood;VIRUS REPLICATION；DISEASE MODELS, ANIMAL;DUCKS
　　叶下珠复方Ⅱ号由叶下珠、苦参、丹参、田三七等组成,具有清热解毒、活血化瘀、健脾补肾作用,临床上主要应用于慢性乙型肝炎和肝纤维化的治疗。前期研究显示［1］：该复方对D氨基半乳糖所致的化学性肝损伤和刀豆蛋白A所致的免疫性肝损伤均有较好的保护作用。体外实验研究显示［2］该复方有较好的抗乙肝病毒作用。为探讨该复方的体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)作用,本研究采用先天感染鸭乙肝动物模型,以荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测用药前后鸭血清DHBVDNA含量变化,现报道如下。
　　1　材料与方法
　　实验动物
　　1日龄广东麻鸭100只,雄性,购自石井朝阳村孵化场,适应性喂养1 d后开始采血
　　实验药物
　　叶下珠复方Ⅱ号组成药物购于广州中医药大学第一附属医院,常规水煎2次,过滤并浓缩至相当于含生药材2 g/mL。拉米夫定由葛兰素史克制药(苏州)有限公司生产,批号：08070007。
　　主要试剂及仪器
　　荧光定量PCR试剂盒(TOYOBO公司,探针型)；96孔板及封口膜(广州市美津公司)；ABI7300型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；Minispin台式离心机(上海Eppendorf公司)； SWJC1F超净工作台(上海阳光实验仪器公司)；BDF1600型双恒水平电泳仪(北京东方仪器厂)； Point215凝胶成像分析系统(BIO公司)。
　　DHBVDNA阳性鸭筛选
　　从第1次采集的鸭血中分离血清,用DNA提取液进行血清DNA提取,提取液组成：02 mol/L NaOH、10 g/L十二烷基磺酸钠。取20 μL血清,加入60 μL提取液,混匀后室温放置10 min，再加入80 μL异丙醇,混匀后4℃、13 000 r/min离心7min,弃上清。加入体积分数40%异丙醇10 000 r/min离心5 min洗1次,然后用20 μL去离子水溶解沉淀。采用PCR法检测DHBVDNA，引物为：GATCCACTCCTGGGAAACAADS1，CAGACCAGCGTGGCTAATTGADS2，扩增产物为589 bp。条件为94℃预变性4 min,然后94℃、30s,56℃、30s,72℃、1 min，进行37个循环,最后再72℃延伸5 min。扩增完毕后进行琼脂糖凝胶电泳,选取电泳条带较为明显者作为DHBVDNA阳性鸭进入下一步实验。
　　分组给药
　　将筛选所得DHBVDNA阳性鸭30只随机分为5组,每组6只,分别为病毒对照组,叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(即中药高、中、低剂量组,剂量分别为336、186、84 g·kg-1·d-1,分别相当于10、5、25倍临床用药剂量),拉米夫定组(剂量为20 mg·kg-1·d-1,相当于10倍临床用药剂量),病毒对照组每天给予生理盐水灌胃,叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组和拉米夫定组分别灌胃给药,各组分别于用药前(T0)、用药第7天(T7)、第14天(T14)、第21天(T21)、第28天(T28)及停药后第5天(P5),自鸭腿胫静脉取血,分离血清,-20℃冻存待检。
　　血清DHBVDNA提取
　　采用辛酸钠法［3］。取40 μL血清,加入20 μL辛酸钠，在99℃加热10 min,然后12 000 r/min离心10 min,取上清液检测。120 mmol/L辛酸钠配制：取80 mg辛酸钠溶解于4 mL超纯水中,储存于冰箱中备用。
　　血清DHBVDNA检测
　　采用荧光定量PCR法,按DHBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作。引物探针序列为：Sense primer：TGGCACGTTTTACTTATATGGATGACATTCC,Antisense primer: ACGAGGCTGATAGGAGCTAGTTTTGTCA, Probe：FAMCCTACTGCCTACCCAAACTCTCGCTACACCGTTAATAMRA,引物浓度04 μmol/L、探针浓度02 μmol/L、荧光定量PCR Master Mix 25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、TaqMan探针2 μL、模板5 μL,加超纯水至50 μL,将加好上述反应物的96孔板封口放入自动荧光检测仪,反应条件为：95℃、60 s预变性,95℃、15 s，60℃、60 s,进行40个循环。反应结束后由计算机自动分析计算DHBVDNA定量结果。
　　统计学方法
　　采用SPSS 100软件包进行统计分析,组间比较(各组与病毒对照组比较)采用Oneway ANOVA,多重比较采用LSD；组内比较(组内T0与其他各采血点比较)采用PairedSamples T Test。
　　2　结果
　　叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组在给药第7、14、21、28天及停药后第5天鸭血清DHBVDNA含量显着降低,与给药前和病毒对照组比较差异均有显着性意义(P＜005或P＜001)。叶下珠复方Ⅱ号中剂量组给药第14、21天鸭血清DHBVDNA含量显着降低,与中药低剂量组比较差异有显着性意义(P＜005),结果见表1、图1。表1各组用药前后血清DHBVDNA含量比较(略)
　　3　讨论
　　乙型肝炎病毒(HBV)持续感染引起的慢性肝损伤是导致肝纤维化和肝硬化形成的主要原因,HBV本身并不损伤肝脏,而是其在肝细胞内持续复制引起宿主产生免疫应答,特别是细胞免疫应答所致的免疫病理损害,是导致肝炎慢性化的病理基础［4］ 。因此针对HBV抗病毒治疗,是阻断慢性肝损伤进一步发展的主要措施。
　　鸭乙肝病毒与人乙肝病毒同属嗜肝DNA病毒科,两者在病毒复制形式、致病机理等方面有很多相似之处,所以鸭乙肝动物模型一直被当作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的动物模型［5］。以往检测鸭血清DHBVDNA动态变化多采用斑点杂交法,此法较经济,适于大规模筛选,但该法主要计算透光度的强弱,斑点面积基本不计算,因此其准确性较差,且当血清病毒载量低于107copies/mL时,斑点已基本不能显示,因此其敏感性也差。另外，实验过程中用到的放射性物质对环境污染较大。本研究采用荧光定量PCR方法检测鸭血清DHBVDNA含量,敏感性可达到反应体系中仅有2个病毒copies,且绝对定量,因此能够准确反映血清中的DHBVDNA含量,实验操作过程简单,且经济适用易行。
　　叶下珠复方Ⅱ号临床上主要应用于慢性乙型肝炎和肝纤维化的治疗本实验研究结果显示叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组在给药第7、14、21、28天及停药后第5天鸭血清DHBVDNA含量显着降低,与给药前和病毒对照组比较差异均有显着性意义(P＜005或P＜001),提示叶下珠复方Ⅱ号具有较好的抑制DHBV复制作用。
　　理想的抗HBV药物应能多环节起作用,既能有效控制病毒复制,又能调节宿主免疫应答以防止肝损伤产生,同时安全性好,长期用药毒副作用少，耐药性小，停药后不易发生反跳,最终清除体内病毒。本实验研究结果显示叶下珠复方Ⅱ号有较好的抗DHBV作用,但其具体作用机制尚需进一步研究。
【参考文献】
　　［1］李小翚,李钢,李常青,等.叶下珠复方Ⅱ号对小鼠实验性肝损伤的保护作用［J］.广州中医药大学学报,2007,24(5):392.
　　［2］李常青,李小月,张俊丽,等.叶下珠复方Ⅱ号体外抗HBV作用的实验研究［J］.中国热带医学杂志,2009,9(2)：217.
　　［3］刘蓉, 李明远,张发强, 等.应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA［J］.世界华人消化杂志, 2007,5(12): 1421.
　　［4］杨绍基,任红.传染病学［M］.北京：人民卫生出版社,2008：31.
　　［5］邓学龙,朱宇同,郭兴伯,等.先天和后天感染鸭乙肝病毒的广州麻鸭外周血中病毒血症的动态比较及应用［J］.广州中医药大学学报,1999,16(1)：56.