浅论抗菌肽Thanatin同系物抗菌机制的初步研究.docx

浅论抗菌肽Thanatin同系物抗菌机制的初步研究【摘要】 目的：研究抗菌肽Thanatin同系物(Sthanatin， Ts)的作用机制以及靶位。方法:进行Ts与脂多糖(LPS)的结合作用实验，用不同组分的磷脂制备出包裹了钙黄绿素的脂质体来模拟多肽与细胞膜的作用，另外研究多肽是否可以促使细胞内半乳糖苷酶的释放来指示细胞膜通透性的变化，用电子显微镜观察细菌在受抗菌肽作用后超微结构的改变。结果：Ts与LPS具有较强的亲和力(50%效应浓度为50 gml-1)，多肽对脂质体有较强的扰乱作用，胆固醇的存在一定程度上抑制了这一作用。电镜图片显示未加药作用的菌体细胞膜边缘比较清晰圆滑，而被多肽作用的菌体细胞膜非常不规则，并且有破裂和内容物的释放。结论：初步阐明多肽Ts是通过作用于磷脂扰乱细胞膜发挥杀菌作用，并且很可能是通过静电作用与LPS结合。【关键词】 抗菌肽; Sthanatin; 磷脂; 细胞膜; 作用机制Abstract Objective: To investigate the antibacterial mechanism of thanatin analog, antimicrobial peptide Sthanatin (Ts). Methods: In this study, we investigated its lipopolysaccharide(LPS)binding and neutralizing activity in vitro. We also investigated the effect of the presence of cholesterol on the interactions of the antimicrobial peptide Ts with phosphatidylcholine (PC) model membrane systems. Diffusion of extracellular onitrophenylDgalactopyranoside (ONPG) into the cytoplasm of E. coli cells was monitored by measuring the production of onitrophenol. To further characterize the antimicrobial activity of Ts, transmission electron microscope (TEM) was employed to confirm morphological changes. Results: The results showed that Ts completely bound to the LPS (its median effective concentration being 50 gml-1). Membrane phospholipid was found to be the target for Ts in calcein leakage assay. Ts had changed the permeability of the membrane. Contrary to negative control, Ts produced chaotic membrane morphology and cell debris in electron microscopic appearance. Conclusion: These results supported our hypothesis that Ts first bound to negatively charged LPS and anionic lipid, and then disturbed the cytoplasmic membrane. This caused damage to the biological function and integrity of membrane. As a subsequence, the intracellular potential was exhausted and periplasmic material was released out of cells, which led to the doom of cells.Key words antimicrobial peptide; Sthanatin; phospholipid; cell membrane; mechanism of action上个世纪，由于抗生素的滥用而不时地引起耐药菌的出现，并且出现的频率逐年上升，以致给未来感染症的治疗造成一定的威胁1。在此情况下，抗菌肽由于具有和抗生素不同的抗菌机制,对细菌不产生耐药性,不具抗原性,表现出广谱的抗菌性,有望成为抗生素的最佳替代者而备受生物学和医学界关注。抗菌肽一般为碱性，作用靶位以微生物膜为主，破坏其屏障而达到杀伤细胞的效果，如防卫素(Defensin)、天蚕肽(Cecropin)、蜂毒肽(Melittin)和马加宁(Magainin)等，但具体破膜方式又有所差异，包括抑制细胞壁、蛋白酶、核酸物质等合成。抗菌肽结构的多样性决定其功能和作用方式的多样性,因此不存在一个统一的学说来解释所有抗菌肽的抗菌机制,目前对于抗菌肽的抗菌机理主要存在5种学说,且集中在抗菌肽与细菌细胞膜作用方面。Thanatin(GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM)是在斑腹刺益蝽血淋巴中发现、分离得到的一种阳离子肽，是来源于昆虫并具有抗真菌、细菌等作用的广谱低毒性的抗菌肽。本实验室以Thanatin作为母版，对其在抗菌时起关键作用的二硫环中的6个氨基酸进行缺失突变和氨基酸替换，从一系列突变体中筛选获得了一个小肽序列，将其命名为Sthanatin(Ts)。之前的研究表明Ts具有广谱抗菌活性，对革兰阴性菌的作用远强于革兰阳性菌，并且对哺乳动物细胞几乎无溶血性等毒副作用，具有选择作用性，对耐药菌有良好效果，并对环境中离子浓度和pH值耐受性好。由于Thanatin的杀菌机理目前尚不清楚，但对于革兰阴性菌来说，其外膜磷脂双分子层的性质或者位于外膜磷脂层中的孔道蛋白通道直接影响着细菌对抗生素的敏感性。那么Ts的作用靶位在哪，是否作用于细胞膜?本研究对该多肽的抗菌作用机制进行了初步研究分析。1 材料与试剂菌株和试剂大肠杆菌ATCC 25922由中国药科大学微生物教研室提供，多肽Ts由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，短杆菌肽、曲通Triton X100和邻硝基苯D半乳吡喃糖苷(ONPG)购自上海生工生物工程技术服务有限公司，显色基质鲎试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)和胆固醇购自美国Avanti公司，葡聚糖G25和钙黄绿素购自Sigma公司，细菌培养基等组分购自BBI公司。主要仪器721可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，F96荧光分光光度计(法国Horiba公司)，旋转蒸发仪RE52AA(上海亚荣公司)，JEM1010共聚焦电子显微镜(日本JEOL公司)。2 实验方法抗菌肽与脂多糖(LPS)的作用按照说明书要求，将Ts以400 gml-1的浓度溶于无热原水，作适当稀释使多肽终浓度为200、100、50、20、10 gml-1，同时标准品内毒素终浓度为 EUml-1，37 下反应60 min后于545 nm处测定吸光度。计算内毒素抑制率(以未加多肽为0抑制率)，绘制出抑制率与多肽浓度关系图。脂质体的制备和模拟细胞膜实验按照参考文献，我们使用了反复冻融5遍、超声过膜来回挤压的方法制备出颗粒均匀的大囊泡单层脂质体，磷脂组成为纯POPC以及含33%摩尔比例胆固醇的POPC。包裹液为含有钙黄绿素的Tris缓冲液。未包裹的钙黄绿素用葡聚糖G25过柱分离，洗脱后配制成500 molL-1脂质体母溶液。多肽倍比稀释，使其与脂质体(45 molL-1)的摩尔比(P/L)从 5到1，室温反应时间1 h保证作用充分, 短杆菌肽作为对照组。采用F96荧光分光光度计对钙黄绿素泄漏溶液进行测量，所选激发波长为490 nm，发射波长为517 nm。记录数据并使用公式(F-F0)/(Fmax-F0)100%计算泄漏率，其中F为加入多肽后脂质体溶液荧光值，Fmax为1% 体积比Triton X100作用下脂质体溶液的荧光值，F0为不加任何物质溶液荧光值。多肽影响细胞膜通透性实验抗菌肽对细菌细胞内膜渗透性检测，参照文献进行。取对数期E. coli菌液(108 CFUml-1)100 l,Tris洗涤后加入作用浓度为 mmolL-1的ONPG溶液和100 gml-1的Ts,37 下水浴，不同反应时间点取样离心后在405 nm下测定OD值。以不加任何药物作用的菌体组作为阴性对照，以% Triton X100作用的菌体组作为阳性对照。菌体在多肽作用后形态学上的变化研究参照Chapple等的方法，取1 ml(OD600=)对数期大肠杆菌,4 000 rmin-1离心5 min,弃上清,无菌生理盐水洗涤。重悬的菌液与500 gml-1的Ts在37 共同孵育1 h(阴性对照样品加入未含多肽的溶液)后,向混合体系中加入相同体积的5%戊二醛固定24 h,用生理盐水离心洗涤数次,再用1%的锇酸固定1 h后离心洗涤,用乙醇梯度脱水,临界点干燥均匀涂布于铜台真空喷金，通过JEM1010扫描电子显微镜观察多肽对大肠杆菌作用后形态的变化。3 结果与分析抗菌肽与LPS的结合作用本实验利用鲎试剂终点显色法考察抗菌肽与LPS的作用，由于LPS普遍存在于革兰阴性菌外膜中，从而验证LPS的存在对多肽的杀菌是否起到桥梁促进作用。从图1可以发现，Ts对内毒素具有抑制作用，在一定程度上降低了内毒素的活性。随着多肽浓度的增加，内毒素的含量逐渐降低，Ts对内毒素的抑制率随着浓度的增加而增加。抗菌肽对内毒素的抑制率为50%时浓度为42 gml-1，而且当抗菌肽的浓度为 200 gml-1时几乎完全抑制了1 EUml-1 LPS的活性。脂质体模拟细胞膜作用不同浓度Ts对不同组分脂质体中钙黄绿素的泄漏率如图2所示。随着浓度的增加，钙黄绿素释放量越多，多肽对磷脂膜的扰动破坏性是显而易见的。另外，含有胆固醇的脂质体泄漏率明显低于不含胆固醇的脂质体，尤其是在多肽低浓度情况下更为显着。胆固醇类物质普遍存在于哺乳动物细胞膜中，是人类细胞膜重要的组成部分，对稳定细胞膜流动性和细胞结构，维持细胞膜的功能发挥着重要作用;而细菌质膜中则不含有胆固醇10，可能正是这种组分上的差异才导致多肽的选择性作用，使其对哺乳动物细胞毒副作用低。另外在短杆菌肽组中未发现钙黄绿素泄漏现象，也正说明了Ts与短杆菌肽作用靶位的差异性，短杆菌肽作用靶点以细胞壁为主，而Ts则作用于磷脂成分，造成扰乱破坏细胞膜的结果。只含有POPC磷脂的脂质体;含有胆固醇的POPC脂质体抗菌肽对细菌细胞膜作用分析半乳糖苷酶是位于细菌细胞质膜上的水解酶，可以将ONPG水解成半乳糖和黄色的邻硝基苯酚，通过培养液OD值的变化测知半乳糖苷酶的活性。若细胞膜的结构遭到破坏，细胞膜的通透性改变，半乳糖苷酶释放到细胞外或ONPG进入到细胞内部，反应体系OD值会有快速的升高。因此，利用半乳糖苷酶对ONPG的水解来检测抗菌肽对细菌细胞膜通透性的影响。从图3可以看出，随着时间的推移半乳糖苷酶的释放(或ONPG的进入)越来越多，并且在作用30 min后有个快速的增加，表明细菌膜受到了严重的损伤，导致通透性增大，更进一步说明Ts作用于细胞膜的靶向性，通过破坏细胞膜的通透性，让胞内营养物质泄出胞外而达到杀菌作用。菌体在多肽作用后形态学上的结构变化图4显示了未加药物作用和加多肽作用1 h的电镜照片。未加药作用的菌体(图4A)细胞膜边缘比较清晰圆滑，而被多肽作用的菌体(图4B)细胞膜非常不规则，出现混乱的膜形态，并且细胞膜破裂，内容物释放。这一现象不同于lactoferricin、defensins和HLP 2的电镜图，后者在电镜图上形成明显的内容物“水泡”，或者形成“鬼影”细胞(失去了细胞质但具有细胞壁等外架结构)。从电镜图中可清晰直观地反映出Ts对细胞膜的破坏，与其他实验共同验证了多肽与细胞膜磷脂结合扰乱膜结构，瓦解膜框架的过程。4 讨 论细菌素lactococcin A能够增加敏感株的膜通透性,导致膜电势崩溃,使胞内和膜质体内的氨基酸、ATP等营养物质外流,但对脂质体无效11。而我们的抗菌肽不仅破坏了细菌膜的通透性，对人工脂质双分子膜也有很强的作用，表明Ts的作用机制与酶或受体等蛋白因子无关, 它们主要是作用于膜脂质的基质磷脂层,通过物理化学机制使膜的通透性增大。抗菌肽与细菌表面相接触是抗菌肽作用于细菌的第一步，通过静电或疏水作用可能是决定抗菌肽活性的关键步骤。LPS或阴离子型磷脂等是革兰阴性菌细胞膜的主要组成部分，而不存在于革兰阳性菌中，正是这种组分上的差异，导致多肽对革兰阴性菌的杀菌活力高于对革兰阳性菌。也正是因为Ts对磷脂的选择性结合，以及哺乳动物和细菌膜组分的差异，多肽在杀菌的同时对动物细胞才无毒副作用。LPS是革兰阴性菌外膜的完整结构组分，与细菌的细胞分裂和死亡密切相关，尤其在抗生素治疗细菌感染时这一作用更为明显12。此外，一些抗菌肽能在巨噬细胞中阻止LPS依赖性细胞因子的表达，在动物模型中阻断败血症的发展13。这些研究同时也表明了抗菌肽和LPS的结合能力与它们的抗菌活性呈正相关。在革兰阴性菌中，LPS是抗菌肽理想的作用位点14。因此，抗菌肽可能不仅用于治疗感染，还可以阻碍内毒素发挥其生物效应。本研究结果显示Ts能结合并中和LPS，说明多肽的杀菌效用与其和LPS结合活力有密切的关系，其很可能是一个限制性的关键步骤。抗菌肽首先通过与LPS或阴离子型磷脂结合，进而深入磷脂双分子层中扰乱细胞膜，影响细胞膜的功能(包括能量的生成传递)，使得膜破裂而致营养物质外流，从而达到杀菌效果。本研究为将Ts进一步开发成为治疗临床耐药菌引起的感染性疾病打下理论和实践基础。由于Ts杀菌机制不同于传统的抗生素，因此有可能在抗耐药菌作用方面具有独特优势，也赋予了Ts用于抗感染治疗的前景。【参考文献】 1 黄佳玲,杨秀静. 832株医院感染病原菌分布特点及耐药性分析J. 东南大学学报：医学版, 2009,28(2):140143. 杜剑平,张青,陈正常. 人抗菌肽与基因工程J. 东南大学学报：医学版, 2003,22(5):350353.GORDON Y J, ROMANOWSKI E G, MCDERMOTT A M. 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