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免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞的影响
【摘要】 目的 研究免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage ，M)的损伤作用机制。方法 以小鼠腹腔巨噬细胞为对象，采用小鼠尾静脉注射地塞米松/只，环磷酰胺/只，小鼠腹腔巨噬细胞培养，检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及腹腔灌洗液中NO2-/NO3-浓度并用形态学方法观察比较免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞的损伤特点。结果 地塞米松和环磷酰胺均能抑制巨噬细胞功能，与对照组比，细胞吞噬功能均显着下降，DEX组腹腔灌洗液中NO2-/NO3-浓度显着升高，Cy组不升高。VitC为自由基链反应阻断剂，阻断过氧化链式反应可减轻损伤，可使DEX组细胞吞噬功能获得部分恢复。结论 推测环磷酰胺对腹腔巨噬细胞损伤是以直接损伤染色体而DEX以氧化损伤为主。
【关键词】 地塞米松 环磷酰胺 巨噬细胞
The effect of dexamethasone and cyclphosphamide on peritoneal macrophage of mice
【Abstract】 Objective We investigated demage mechanism of peritoneal macrophage(M) induced by injection of dexamethasone and cyclophosphamide in　The immune function by determining the phagocytic function and structure of the macrophagocytes of the abdominal cavities of mice in vitro. The phagocytosis of peritoneal macrophages was evaluated by chicken erythrocytes method; Observed the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage　Dexamethasone and cyclophosphamide induced the apoptosis of peritoneal macrophage and concomitant decrease of phagocytosis(vs control group，)， the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid significantly increased after dexamethasone injection;VitC(inhibitor of iNOS and inhibitor of reactive oxygen species) prevented the apoptosis of peritoneal macrophage and reduced the concentration of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid after the effect of　These evidences support that NO and active oxygen species may be involved in the apoptosis process of peritoneal peritoneal macrophage induced by dexamethasone in mice.
【Key words】 dexamethasone cyclophosphamide macrophage
　　地塞米松和环磷酰胺在临床肿瘤的治疗中是常用的药物，在杀伤肿瘤细胞的同时又会引起免疫系统损伤，而影响治疗效果。巨噬细胞(macrophage，M)是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞，具有非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能，并具有抗原提呈作用。本实验选用小鼠腹腔巨噬细胞进一步探讨在整体条件下地塞米松和环磷酰胺对免疫功能影响的机制。
1 材料和方法
　实验分组及动物处理 昆明种雄性小鼠，日龄55～58天60只分为5组：正常对照组；DEX组：腹腔注射地塞米松150μg/只，每日1次，连续注射3次；Cy组：腹腔注射环磷酰胺/只，每日1次，连续注射3次；VitC+DEX组：与DEX组同时注射；VitC+Cy组：与Cy同时注射；给药第2天上述小鼠腹腔注射2%无菌淀粉1ml。
　腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 于第4天取各组6只，小鼠腹腔注射5%鸡红细胞1ml，30min后，引颈处死小鼠，腹腔注射D-HanKs 1ml，轻轻按揉腹壁1min，吸出腹腔液滴片。置37°C湿盒孵育30min后，用PBS冲洗，去除未贴壁M和游离鸡红细胞，1：1丙酮-甲醇固定7～8min，自然晾干。有姬母萨-瑞士染液进行染色油镜下计数M和M吞噬CRBC数。用下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数：吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的M/100个M×100% 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/100个M。
　细胞涂片Giemsa染色 各组小鼠第4天引颈处死，腹腔注射D-Hanks液5ml，吸出腹腔液4℃ 500r/min，去上清与PBS制成细胞悬液，调细胞为1×106个/ml，100μl涂片，凉干后甲醇固定，晾干Giemsa染色，普通光镜下观察细胞形态变化。
　腹腔巨噬细胞NO检测 NO2-/NO3-的测定按NO试剂盒说明书操作，最后测定500nm吸光度值。NO2-/NO-3=/。
2 实验结果
所有数据均采用单因素方差分析法进行统计学分析，并采用Student-NK检验法进一步检验。腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定结果见表1。DEX和Cy注射组小鼠M的吞噬百分率和吞噬指数均明显降低，与生理盐水对照组比较具有高度统计学意义;VitC+DEX组M的吞噬百分率和吞噬指数比DEX组有显着提高；VitC+Cy组M的吞噬百分率和吞噬指数较Cy组差异无显着性。形态学变化可见：DEX组和Cy组较对照组出现明显形态变化细胞变小，染色质凝聚，细胞质浓缩，可见凋亡小体。
腹腔巨噬细胞NO检测结果见图1：小鼠腹腔灌洗液中NO浓度测定显示：与对照组比，DEX组NO2-/NO-3浓度显着上升，而VitC能部分逆转NO浓度，但对Cy组无明显改善。 表1 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定结果

注：①与对照组比较，;②与对照组比较，;③与DEX组比较，；④与Cy组比较，

图1 腹腔巨噬细胞NO检测结果注：①与对照组比较，P＜;②与DEX组比较，P＜，③与DEX组比较，P＜;④与Cy组比较，P＞
3 讨论
巨噬细胞是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞，本实验选用腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法来观察免疫抑制剂对巨噬细胞的影响。结果可见，免疫抑制剂可显着抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力；VitC能明显改善地塞米松对巨噬细胞的影响。文献报道抗氧化剂VitC通过清除氧自由基和降低脂质过氧化提高机体免疫功能［1～3］机体氧化-抗氧化的平衡对维持正常的免疫功能具有重要的作用，它影响到免疫细胞膜磷脂、细胞内蛋白、核酸的完整性和免疫信号的传导及基因表达。免疫细胞由于其细胞膜磷脂含有较高的不饱和脂肪酸，因此对氧应激非常敏感［4］。已有实验证明VitC有很强的抗氧化作用，注射VitC可明显减弱DEX对小鼠巨噬细胞吞噬功能的抑制作用，分析DEX对巨噬细胞的免疫抑制作用可能与其氧化损伤有关。文献报道［5］抗氧化剂维生素C通过抑制DEX诱导的淋巴细胞凋亡增强淋巴细胞的增殖能力，VitC具有抗氧化作用，提示通过抗氧化促进细胞增殖，抑制DEX诱导的淋巴细胞的凋亡。巨噬细胞具有非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能［6］。静止的巨噬细胞胞体小，细胞活性低，吞噬功能弱。当巨噬细胞被激活后，细胞胞体变大、表面突起增多，细胞内有完整的细胞器，且溶酶体、线粒体增多，细胞吞噬功能增强。本实验结果显示，VitC改善巨噬细胞吞噬功能，形态学观察发现，VitC处理的M细胞表面突起增多，细胞伸展率提高并能对抗DEX引起的细胞变小，伸展性差，细胞聚集成团现象。有研究报道DEX可降低M的吞噬作用［7，8］，Grasso等［9］研究发现DEX与M体外共同孵育可抑制M细胞吞噬功能，但培养液中一旦去除DEX，M吞噬功能很快便得到恢复。DEX具有诱导免疫细胞凋亡的作用［10］。M凋亡的机制十分复杂，近年的研究发现许多因素与M凋亡有关。巨噬细胞受到刺激或进行吞噬作用后，发生呼吸暴发，可产生大量的活性氧及NO等活性物质［11］。是巨噬细胞在肿瘤免疫中发挥独特作用的基础，一定浓度的NO又是M凋亡信息传递通路中的关键环节，通过调控巨噬细胞自身凋亡保持巨噬细胞数量恒定［12］。有研究报道凋亡时活性氧和NO或减少或增多［13］，机制尚不清。本实验结果提示DEX诱导巨噬细胞凋亡与NO生成增多有关。NO是一种自由基气体，其不成对电子在氮原子上，为氮自由基参与细胞内和线粒体内的链式反应，VitC为自由基链反应阻断剂，减轻损伤，能部分抑制巨噬细胞凋亡，细胞吞噬机能也获得部分恢复，以DEX组较显着。本实验提示VitC以抗氧化与抑制DEX诱导的M凋亡有关。推测环磷酰胺诱导腹腔巨噬细胞凋亡是以直接损伤染色体而DEX以氧化损伤为主，VitC以抗氧化作用而减轻DEX诱导的M凋亡。【参考文献】
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