GdCl3对小鼠肝脏再生早期Cyp7A1基因转录的影响.docx

GdCl3对小鼠肝脏再生早期Cyp7A1基因转录的影响
【摘要】 　　目的： 探讨小鼠肝脏再生早期氯化钆(GdCl3)通过作用于枯否细胞影响胆酸介导的Cyp7A1基因转录的抑制. 方法： 运用GdCl3 (10 mg/kg, iv.) 或PBS ( mL, iv.) 处理C57BL/6小鼠24 h后，切除小鼠70%的肝脏，于术后第1日处死小鼠，收集肝脏，采用实时定量RTPCR方法检测肝脏中Cyp7A1, TNFα和IL6基因的表达. 结果： 肝脏再生的第1日, 与PBS对照组相比, GdCl3处理组中Cyp7A1 mRNA 的表达降低(), 而细胞因子TNFα和IL6 mRNA 的表达升高 (). 结论： 在肝脏再生的早期, GdCl3可增进胆酸介导Cyp7A1基因转录的抑制, 这种作用是通过促使枯否细胞产生细胞因子TNFα 和IL6来实现.
【关键词】 GdCl3；枯否细胞；细胞因子类；Cyp7A1基因；肝再生
　　Effect of gadolinium chloride on Cyp7A1 gene transcription during early stages of mouse liver regeneration
【Abstract】 AIM: To observe the effect of gadolinium chloride (GdCl3 ) on Kupffer cells regarding the bile acidmediated suppression of Cyp7A1 gene transcription during early stages of the mouse liver regeneration. METHODS: Twenty four hours before 70% hepatectomy, C57BL/6 mice were treated with either GdCl3 (10 mg/kg, iv) or PBS ( mL, iv). Mice were sacrificed at the first day after surgery. Livers were harvested and Cyp7A1, TNFα , IL6 gene expressions were measured by realtime RTPCR. RESULTS: During the first day of liver regeneration, compared to the PBS pretreated mice, the Cyp7A1 gene expression was dramatically decreased (). In contrast, the TNFα and IL6 gene expressions were significantly increased in GdCl3 pretreated mice (). CONCLUSION: During the early stages of liver regeneration, the enhanced effect of the bile acidmediated suppression of Cyp7A1 gene transcription by GdCl3 is via its stimulation of cytokine production from Kupffer cells.

【Keywords】 GdCl3; Kupffer cells; cytokines; Cyp7A1 gene; liver regeneration
　　0引言
胆固醇在肝脏内代谢为胆酸是胆固醇从体内清除的重要方式. Cyp7A1基因编码胆固醇转化成胆酸过程中的限速酶胆固醇7α羟化酶. 胆酸可通过多种机制来反馈抑制Cyp7A1基因的表达［1］. Miyake 等［2］研究发现当胆酸在肝脏内达到一定浓度时，会诱导枯否细胞合成并释放细胞因子. 这些细胞因子作用于肝细胞后，可导致Cyp7A1基因表达的抑制. 通过调控Cyp7A1基因的表达来保持胆酸代谢的平衡是小鼠肝脏部分切除术 (partial hepatectomy, PH) 后正常再生的重要条件. 氯化钆(gadolinium chloride, GdCl3) 是一种稀有的地球金属，它可以破坏肝脏枯否细胞的功能，因此常被用来研究与枯否细胞相关的疾病或毒性过程的发生机制. GdCl3的作用效应目前还有争议. 本研究探讨在小鼠70%PH术后再生的早期，GdCl3影响枯否细胞参与胆酸负反馈抑制Cyp7A1基因表达的过程.
1材料和方法
材料雄性，出生8~10 wk的C57BL/6小鼠36只，体质量22~26 g；GdCl3；TRI试剂 ，溴氯丙烷(美国Molecular Research Center公司)；异丙醇 ， 二乙基焦磷酰胺(美国 Sigma公司 )； MMLV 逆转录酶(美国Invitrogen公司)；重组核糖核酸酶抑制剂(美国Promega公司)；SYBRGreen PCR Master Mix，7300 实时定量PCR 系统(美国Applied Biosystems公司)；Polytron PTMR2100匀浆器 (美国Lyophiler/polytron )；CS6R低温离心机，640B分光光度计(美国Beckman).
方法
动物实验实验动物随机分为未行手术而仅给予PBS静注组和70% PH术后PBS对照组(C组)三组,每组动物各12只.A组仅给予小鼠尾静脉注射PBS　mL； B,C两组分别于70% PH术前24 h, 小鼠尾静脉注射GdCl3 10 mg/kg或注射PBS　mL. 行70% PH手术的小鼠,其肝脏的左外叶，尾叶和中叶将被完全切除，胆囊保持完整无损. 于术后第1日，将三组小鼠全部处死，收取肝脏，在液氮中速冻后保存于-80℃冰箱备用.
小鼠肝脏总RNA的抽提和cDNA的合成取100 mg肝脏组织，在TRI试剂中匀浆后，根据说明书的方法进行RNA抽提. 取3 μg RNA，以oligodT为引物,在20 μL反应体系65℃预变性10 min后, 再加入5xFS Buffer，/L DTT, 25 mmol/LdNTP, Rnasin和MMLV至反应体系30 μL , 42℃ 1 h.
实时定量PCR应用7300 SYBRGreen实时定量PCR系统定量检测小鼠肝脏中Cyp7A1, TNFα和IL6基因 的表达. 使用的正向引物 和反向引物包括Cyp7A1 (F) CAAGAACCTGTACATGAGGGAC; Cyp7A1 (R) CACTTCT TCAGAGGCTGCTTTC; TNFα ( F) TGTCTACTGA ACT TCGGGGTGATC; TNFα ( R) GGTTGTCTTTGAGATCC ATGCCGT; IL6( F) TTCCTCTGGTCTTCTGGAGTAC; mIL6 (R) CCTTCTGTGACTCCAGCTTATCPCR 反应体系为20 μL: SYBR Green PCR Master Mix 10 μL, cDNA 5 μL, 各 μL 20 μmol/L 正向引物 和反向引物. 余用ddH2O 补足. 同时以 βactin 基因的PCR产物作为内参照. 反应程序为: 50℃ 2 min, 95℃ 10 min, 95℃ 15 s, 55℃ 1 min共40个 循环. 为检测PCR产物的单一性,制作溶解曲线, 程序为: 95℃ 15 s, 55℃ 30 s. 样品cDNA扩增得到的Ct值，在标准曲线上定量后得到的数值与内对照相比即为该样品mRNA的相对值
统计学处理： 所得数据以 x±s表示, 采用方差分析以及多样本均数的两两比较,组间方差不齐时,行非参数秩和检验.采用SPSS 统计学软件进行分析, 为差异具有统计学意义.
2结果
　mRNA 的表达情况70%PH术后第1日小鼠与A组相比较, 肝脏中Cyp7A1 mRNA 的表达在B组和C组均明显降低（),且B组中Cyp7A1 mRNA 的相对值明显低于C组（,图1).
,　vs PBS;　vs GdCl3+PH 1 d.
图170% PH术后第1日小鼠肝脏中Cyp7A1 mRNA 的表达(n=12, x±s)
细胞因子TNFα和IL6 mRNA 的表达情况70% PH 术后第1日小鼠与A组相比较, 肝脏中细胞因子TNFα和IL6 mRNA 的表达在B组和C均明显升高（),且B组中TNFα和IL6 mRNA 的相对值明显高于C组（，图2，3).
,　vs PBS;　vs GdCl3+PH 1 d.
图270% PH 术后第1日小鼠肝脏中TNFα mRNA 的表达(n=12, x±s)
,　vs PBS;　vs GdCl3+PH 1 d.
图370% PH 术后第1日小鼠肝脏中IL6 mRNA 的表达(n=12, x±s)
　　3讨论
　小鼠肝脏70% PH术后, 堆积的胆酸作为一种信号,促使肝脏通过再生来减轻胆酸的负荷，同时通过抑制Cyp7A1基因的表达来减少胆酸的生成［3］. 本实验结果显示与A组相比, B,C两个实验组 在术后第1日, 由于胆酸浓度的升高, 肝脏中Cyp7A1 mRNA 的表达均明显降低. 证实70% PH术后肝脏再生的早期，胆酸可通过负反馈抑制Cyp7A1基因的转录.
从门静脉返回肝脏的胆酸可通过激活肝细胞的核受体法呢醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)来抑制Cyp7A1基因的表达［4］，在肝脏再生的早期，非依赖FXR的通路参与胆酸介导的Cyp7A1基因表达的调控［3］. 胆酸与肝脏枯否细胞作用后，促使枯否细胞产生和释放细胞因子如TNFα 和 IL6,细胞因子通过激活肝细胞内蛋白激酶C介导的通路来抑制Cyp7A1基因的表达［5］.
GdCl3是一种稀有的金属，由于它可以阻断肝脏枯否细胞的功能，常用其来研究枯否细胞参与的生理或病理生理过程. 目前人们对GdCl3的作用效应还未完全达成共识. 有的认为它可以阻止活化的枯否细胞释放炎性细胞因子和毒性氧自由基如超氧阴离子［6-7］. 有研究报道GdCl3会刺激枯否细胞产生炎性细胞因子TNFα［8-9］. Ding等［10］认为高剂量的GdCl3作用于枯否细胞后会导致枯否细胞胞膜破裂. 本研究实验结果表明，在小鼠70% PH术后第1日，经GdCl3预处理24 h的实验组中，肝脏组织Cyp7A1基因的表达较对照组明显降低，GdCl3处理组中两种细胞因子的表达均较对照组显着升高. 提示GdCl3可通过促使枯否细胞产生细胞因子TNFα 和IL6来增进细胞因子介导通路的活化，最终导致Cyp7A1基因转录的抑制.
【参考文献】
［1］Chiang JY. Regulation of bile acid synthesis: Pathways, nuclear receptors, and mechanisms ［J］. J Hepatol, 2004, 40(3): 539-551.
［2］Miyake JH, Wang SH , Davis RA. Bile acid induction of cytokine expression by macrophages correlates with repression of hepatic cholesterol 7aHydroxylase ［J］.J Biol Chem, 2000,275(29): 21805-21808.
［3］Huang W, Ma K, Zhang J, et al. Nuclear receptordependent bile acid signaling is required for normal liver regeneration［J］. Science,2006, 312(5771):233-236.
［4］Goodwin B, Jones SA, Price RR, et al. A regulatory cascade of the nuclear receptors FXR, SHP1, and LRH1 represses bile acid biosynthesis［J］. Mol Cell, 2000,6(3): 517-526.
［5］Davis RA, Miyake JH, Hui TY, et al. Regulation of cholesterol7αhydroxylase: BAREly missing a SHP［J］. J Lipid Res, 2002, 43(4):533-543.
［6］Michael SL, Pumford NR, Mayeux PR, et al. Pretreament of mice with macrophage inactivators decreases acetaminophen hepatotocity and the formation of reactive oxygen and nitrogen species［J］. Hepatology,1999,30(1):186-195.
［7］Hardonk MJ, Dijkhuis FW, Hulstaert CE, et al. Heterogeneity of rat　liver and spleen macrophages in gadolinium chlorideinduced elimination and　repopulation. ［J］. J Leukocyte Biol, 1992,52(3):296-302.
［8］Rose ML, Bradford BU, Germolec DR, et al. Gadolinium chlorideinduced hepatocyte proliferation is prevented by antibodies to tumor necrosis factor alpha［J］. Toxicol Appl Pharmacol, 2001,170(1):39-45.
［9］Kinoshita M, Uchida T, Nakashima H, et al. Opposite effect of enhanced tumor necrosis factorproduction from Kupffer cells by gadolinium chloride on liver injury/mortality in endotoxemia of normal and partially hepatectomized mice ［J］. Shock, 2005,23(1):65-72.
［10］Ding H, Peng R, Reed E, et al. Effects of Kupffer cell inhibition on liver function and hepatocellular activity in mice［J］. Int J Mol Med, 2003, 12(4): 549-557.