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RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响

　　【关键词】 RNA干扰；ERCC1基因；卵巢癌；耐药
　　摘要：目的：观察RNA干扰沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞耐药的影响。方法：体外合成靶向于ERCC1基因的小干扰RNA(ERCC1-siRNA),用脂质体法转染至卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,RT-PCR方法检测转染前后细胞内ERCC1 mRNA的表达，Western blot方法检测ERCC1基因蛋白表达的改变，MTT实验检测转染前后COC1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果：转染ERCC1-siRNA后，COC1/DDP细胞中ERCC1基因的mRNA和蛋白表达均明显减少。RNA干扰联合顺铂用药能明显提高COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论：RNA干扰ERCC1基因能明显抑制COC1/DDP细胞内ERCC1基因mRNA和蛋白的表达，增加COC1/DDP细胞对化疗药顺铂的敏感性。
　　关键词： RNA干扰； ERCC1基因； 卵巢癌； 耐药
　　Effect on Cytotoxicity by RNAi ERCC1 Gene Expression in Ovarian Cancer CelI Line
　　Abstract： Objective:To study the effect on drug resistance by RNAi mediated ERCC1 gene silencing in ovarian cancer cell line. Method:Small interference RNA targeted ERCC1 gene was synthesized in vitro and was transfected into COC1/DDP cell． The expression of ERCC1 was detected by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot .MTT test were applied to measure the inhibition combined with cisplatin of COC1/DDP strain．Result：After transfection of ERCC1-siRNA,mRNA and protein levels of ERCC1 gene in COC1/DDP cells were obviously reduced；ERCC1 gene combined with cisplatin increases the sensitivity to chemotherapy．Conclusion: ERCC1-siRNA could reduce the expression of ERCC1 gene and increase the sensitivity to cisplatin in COC1/DDP cell.
　　Key words： RNAi; ERCC1 gene; Ovarian cancer; Drug-resistance
　　卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其5年生存率仅为20%～30%。治疗的难点为卵巢癌细胞对化疗药物―尤其是一线化疗药顺铂产生耐药性，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应。ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER) 基因家族成员之一，与卵巢癌化疗耐药密切相关［1］。ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因。RNA干扰技术是近10年出现的一种研究基因功能和进行基因治疗的一种新方法，是外源双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平沉默靶基因，阻断基因的表达［2］。由于RNAi具有序列特异性和高效性，目前已成为抗肿瘤基因治疗的有效手段。本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点，针对ERCC1基因设计合成小干扰RNA，在脂质体的介导下转染人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP，以RT-PCR及Western blot方法检测RNA干扰前后细胞内ERCC1基因mRNA及蛋白表达水平的改变。采用MTT实验检测RNA干扰ERCC1基因后卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP对顺铂敏感性的改变，以探讨逆转卵巢癌化疗耐药的新方法。
　　1 材料与方法1 材料与试剂：卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心。RNA干扰试剂盒购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000、Trizol RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。ERCCI鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP、Actin(1～19)多克隆抗体SANTA CRUZ公司。2 细胞培养：COC1/DDP细胞常规培养于含10％胎牛血清，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37℃ 、5％CO2孵箱培养。在培养过程中加顺铂1mg/L以维持耐药性，实验前3d停药。3 小干扰RNA的构建：根据siRNA设计原则和GeneBank中ERCC1基因的编码序列，选择以AA开始长21nt的核苷酸序列为反义模板，与之互补链为正义模板 ，两者3‘端均加上T7启动子引物，序列为：5‘CCTGTCTC 3‘。ERCC1-siRNA模板序列的两条链分别为5‘AAGGAAGAAATTTGTGATACCCCTGTCTC 3‘和5‘AAGGTATCACAAATTTCTTCCCCTGTCTC 3‘。两条链经体外转录合成dsRNA。4 siRNA的转染：细胞接种于含10％胎牛血清、50U／ml青霉素、50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃ 、5％CO2培养箱孵育，实验前无药培养3d。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为×105／ul，接种于24孔板中(每孔500ul)，用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000,按试剂盒说明进行操作，转染ERCC1- siRNA后48h收集细胞做以下实验。5 半定量RT-PCR 检测转染前后COC1/DDP细胞中ERCC1 mRNA的表达从未转染和转染48h后的细胞中提取细胞总RNA，按逆转录(RT)试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。聚合酶链(PCR)反应，上游引物:5‘TCGATCCCTCTGCAGTCTTT 3‘,下游引物:5‘ATTGCGCACGAACTTCAGTA 3‘，扩增片段约为447bp。PCR反应体系50ul，反应条件：预变性94℃5min，94℃ 变性30s，60℃ 退火40s，72℃延伸40s，30个循环，末次延伸10min。实验以GAPDH为内参照，其上游引物:5‘TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG 3‘，下游引物：5‘CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 3‘,扩增片段约为983bp。具体操作过程参照说明书进行，扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳观察。6 Western blot检测细胞内ERCC1蛋白水平的变化：转染后48h收集细胞，蛋白上样缓冲液裂解细胞，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白定量。40g蛋白进行15％SDS-PAGE凝胶电泳，以蛋白电泳转移仪将产物转至NC膜上，室温封闭2h。加入1：1 00 ERCC1鼠抗人单克隆抗体，4℃反应过夜，PBS洗膜，加入1：1000羊抗鼠IgG／HRP，室温孵育2h，化学发光试剂反应5min，发光成像仪取像。7 MTT试验：取对数生长期细胞，脂质体转染6h后，每孔细胞加入20ul不同浓度的DDP继续培养，对照组加无血清、无抗生素的培养基，每个药物浓度设3个复孔。转染48h后，每孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT，4h后离心，加入DMSO 100ul，震荡后置酶标仪546nm处测定吸光度值。8 统计学分析：采用SPSS11．0 for windows统计软件处理，采用t检验。

　　2 结果
　　ERCC1-siRNA的鉴定和定量：合成的ERCC1-siRNA经12%丙烯酰胺凝胶电泳可见一条21-21bp的双链RNA条带。将合成的siRNA稀释后测定260nm的吸光度值，提示合成的siRNA产量在40～110ug之间。
　　应用RT-PCR法检测RNA干扰前后COC1/DDP细胞中ERCC1基因的转录水平(图1)。各组细胞在相对于447bp的位置均可见ERCC1基因电泳带存在，但其亮度存在明显差异，干扰组电泳带亮度明显弱于非干扰组。
　　图1 半定量RT-PCR检测转染ERCC1-siRNA前后COC1/DDP细胞中ERCC1 mRNA表达
　　图1：M为分子量Marker,泳道1为转染后ERCC1mRNA的表达，2为转染后ERCC1mRNA的表达，3、4为β-actin对照
　　转染ERCC1-siRNA后细胞中ERCC1蛋白的表达：采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测COC1/DDP细胞中ERCC1基因蛋白的表达(图2)，结果显示在位于36KD处出现ERCC1特异性蛋白杂交带，但转染前后条带亮度有明显差异，其中RNA干扰组细胞的蛋白条带亮度明显低于对照组。
　　图2 Western blot检测转染ERCC1-siRNA前后COC1/DDP细胞中ERCC1蛋白的表达
　　MTT实验：转染ERCC1-siRNA后，卵巢癌细胞COC1/DDP对化疗药物顺铂的敏感性增强，IC50值在干扰前为±/ml, 干扰后为 ±/ml；IC50值在干扰后比干扰前下降倍，两者相比差异具有显着性(P0．
　　05)。
　　3 讨论

　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近年来发现的一种重要基因沉默现象,是存在于真核生物体内的一种自我保护现象,能对抗外源导入或病毒基因所表达的mRNA等外源基因的侵害，也能降解自身异常基因产生的mRNA［3］。高效特异的阻断基因的表达是RNAi的一大特征。在线虫、果蝇体内．RNAi能达到基因敲除的效果，在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功的阻断了基因的表达,实现了细胞水平的基因敲除［4］。ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER) 基因家族成员之一，与肿瘤化疗耐药密切相关。多相研究表明，ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因［5，6］。因此，以ERCC1为靶基因的靶向治疗以逆转肿瘤的耐药，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性成为卵巢癌治疗的新途径。本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点，针对ERCC1基因mRNA设计小干扰RNA，采用体外合成的方法合成dsRNA，将其转染至卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP，用RT-PCR和Western blot方法分别在mRNA及蛋白水平检测ERCC1基因表达，结果显示ERCC1-siRNA能有效干扰ERCC1基因的表达，阻断mRNA向蛋白质的信息传导，进而达到对目的基因的抑制作用。结果与文献报道相一致［7］。MTT实验显示了转染ERCC1-siRNA后，COC1/DDP细胞对顺铂的反应性明显增强，提高了化疗药物对肿瘤细胞生长的抑制作用，部分逆转了COC1/DDP细胞对顺铂的耐药。证实了RNA干扰技术在肿瘤基因治疗领域的作用。由于RNA干扰技术具有特异、高效抑制靶基因表达的特性，因而成为抗肿瘤基因治疗的新方法，在肿瘤基因治疗领域显示了诱人的前景。但由于肿瘤细胞产生耐药机制具有复杂性，因此，需要进行更深入的研究以观察RNAi逆转肿瘤细胞耐药的疗效。
　　参考文献：
　　［1］ Britten RA，Liu D，Tessier A，et　expression as a moleculax marker of cisplatin resistance in human cervical tumor cells［J］. Cancer，2000，89(5)：45３-457.
　　［2］ Paddison PJ,Can dyAA,Hannon GJ. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(3)：1443-1438．
　　［3］ Borkhardt A. Blocking oncogenes in malignant cells by RNA interference-new hope for a highly specific cancer treatment［J］.Cancer Cell，2002，2：167-168．
　　［4］ SIIi G，Soohoo C，Afar EIB，et a1. A NDA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells［J］.Proc Natl Acad Sci，20O2，99(8)：5515-5520．
　　［5］ Selvakumaran M ，Pisareik DA，Bao R，et a1. Enhanced cisplatin cytotoxicity by disturbing the nueleotide excision repair pathway in ovarian cancer cell lines［Ｊ］. Cancer Res，2003，63(6):1311-1316．
　　［6］ Zhong X，LiQ Q，Reed E. SU5416 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin through inhibition of nueleotide excision repair［Ｊ］. Geu Mol Life Sci，2003，60(4)：794-802．
　　［7］ Metzger R，Leichman CG，Danenberg KD，et a1. ERCC1 mRNA levels complement thymidylate synthase mRNA levels in predicting response and survival for gastric cancer patients receiving combination cisplatin and fluomuracil chemotherapy［J］． Clin Oncol，1998，16(1)：309-316．