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丹参注射液促心肌梗塞后大鼠缺血心肌血管新生作用及对相关生长因子的影响研究
【摘要】 目的观察丹参注射液对心肌梗塞后大鼠缺血心肌血管新生作用，并探讨其机制。方法雄性Wistar大鼠，结扎左冠状动脉造成急性心肌梗塞模型，随机分为丹参注射液组、麝香保心丸组、模型组，并设假手术组，6周后处死动物。用免疫组织化学法，检测各组大鼠缺血心肌中微血管数、微血管密度及血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子β、胰岛素样生长因子蛋白的表达，用病理图像分析系统测定生长因子蛋白表达灰度值并进行半定量分析。结果模型组、麝香保心丸组及丹参注射液组大鼠MI边缘区MVC和MCD较假手术组明显增多；丹参注射液组大鼠缺血心肌局部MVC和MVD明显高于模型组，与麝香保心丸组作用相似。模型组VEGF，bFGF-β，IGF-1蛋白表达及其灰度值明显高于假手术组；丹参注射液组VEGF，bFGF，PDGF-β蛋白表达灰度值明显高于模型组，而IGF-1蛋白表达灰度值低于模型组VEGF，bFGF，PDGF-β，IGF-1蛋白表达灰度值低于麝香保心丸组。结论丹参注射液有促MI后大鼠缺血心肌血管新生的作用，其机制可能与促进VEGF，bFGF，PDGF-β的表达有关。
【关键词】 丹参注射液 心肌梗塞 血管新生 分子机制
　　Study of Angiogenesis and Correlative Growth Factors Effects of Salvia miltiorrhiza Injection on the Ischemic Myocardium of the Rats after Myocardial Infarction
　　Abstract：ObjectiveTo study the angiogenesic effects and mechanisms of Salvia miltiorrhiza Injection on the ischemic myocardium of the rats after myocardial infarction(MI).MethodsMale wistar rats were ligated left coronary artery to be made into models of acute myocardial infarction (AMI). All rats were randomly divided into Salvia miltiorrhiza Injection, Shexiang baoxin pills (positive control group), model (negative contral group) group and sham operation group. Treated them respectively for six weeks. Microvascular count(MVC), microvascular density (MVD), vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-kind growth factor (IGF) and platelet-derived endothelial growth factor (PDGF) in ischemic myocardium of MI rats were detected by immunobistochemistry assay. The values of protein expression of VEGF,bFGF, PDGF-β and IGF-1 on ischemic myocardyzum were calculated and analied by image analysis　There were more MVC and MVD in ischemic myocardium of AMI rats of model group、salvia miltiorrhiza injection group, Shexiang baoxin pills group than sham operation group. MVC and MVD were higher in ischemic myocardium of AMI rats of Salvia miltiorrhiza Injection group than those of model group. Compared with Shexiang baoxin pills, they had the same roll. The values of protein expression of VEGF, bFGF, PDGF-β and IGF-1 in model group were significantly elevated compared with that in sham operation group. The protein expression of VEGF, bFGF and PDGF-β in salvia miltionrrhiza injection group was significantly elevated compared with that in sham operation group. The protein expression of VEGF,bFGF and PDGF-β in Salvia miltiorrhiza Injection group was significantly elevated compared with that in model group. IGF- 1 in Salvia miltiorrhiza Injection group was lower than modle group. But there was no significant statistics difference between them. There were significant statistics differences in the protein expression of VEGFbFGF,PDGF-βand IGF-1 in salvia miltiorrhiza injection group compared with that in Shexiang baoxin pills group. Conclusion Salvia miltiorrhiza Injection has the effect of promoting angiogenesis of the ischemic myocardium in rats after MI. Its mechanisms can be related with stimulating the expression of VEGF,bGFG and PDGF-β.
　　Key words：Salvia miltiorrhiza Injection; MI; Angiogenesis; Molecular mechanism
本研究观察丹参注射液对MI后大鼠缺血心肌血管新生的影响，并通过观察其对相关生长因子蛋白表达水平的变化探讨促血管新生作用机制。
　　1 材料与方法
　　材料
　　药品丹参注射液，上海第一生化药业有限公司生产，批号031001；麝香保心丸，上海和黄药业有限公司生产，批号A040214，把麝香保心丸粉碎后溶于无菌蒸馏水中，每毫升含麝香保心丸3 mg。
　　试剂小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体，购自美国Santa公司，生物素化二抗、三抗、非免疫血清购自福建迈新公司；VEGF、bFGF、IGF-1、PDGF-β免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，SP-9001 Rabbit SP Kit购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中山公司。
　　器材小动物呼吸机；显微镜；石蜡切片机；彩色病理图像分析系统。
　　动物造模及分组选取体重为 g的Wistar 雄性大鼠，参照文献方法［1］，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，背位固定，行气管插管术，连接小动物呼吸机，人工呼吸，开胸结扎左冠脉根部，以即刻心脏表面颜色变化和术后心电图1、aVL导联ST段显着抬高显示造模成功，缝合胸壁，观察大鼠生理状态平稳后，停止人工呼吸，术后注射青霉素3 d预防感染。成活动物随机分为丹参注射液组、麝香保心丸组、模型组，假手术组手术方法同上，但在冠状动脉下穿线后打一松结。
　　治疗方法造模后24 h内开始药物干预，给药1次/d。假手术组腹腔注射生理盐水10 ml·kg-1·d-1；丹参注射液组腹腔注射丹参注射液 g·kg-1·d-1；麝香保心丸组管饲麝香保心丸30 mg·kg-1·d-1；模型组管饲与治疗组同等容积的生理盐水10 ml·kg-1·d-1。6周后处死动物。
　　心肌取材麻醉大鼠后取出心脏，剪去主动脉弓、右心室、心房、心耳等，在乳头肌横切面切取心肌组织10%中性缓冲福尔马林液固定，石蜡包埋，制备厚4 μm组织切片。
　　观察指标
　　一般组织形态学观察切片脱腊，二甲苯透明，HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固，光镜观察。
　　大鼠MI边缘区心肌MVC，MVD的测定用免疫组织化学法染色组织切片。一抗工作浓度为1∶100。染色后血管内皮细胞被染成黄、棕色。微血管判断标准：按参考文献方法［2］，不以红细胞的出现来确定是否为血管，也不以是否出现管腔来计数血管，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层血管区域的血管均不计数。具体方法为：先在40×视野下找到MI边缘区，然后在400×视野下进行大鼠MI边缘区微血管计数，每张切片随机选取5个视野，计数每个视野的MVC，取其均值作为本例大鼠的MVC值，因MVD以毛细胞血管个数/视野表示，故每例的MVC值即为该大鼠的MVD值。
　　大鼠MI边缘区心肌VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表达的检测采用免疫组织化学法染色组织切片。兔抗鼠VEGF，bFGF,PDGFβ和IGF1多克隆抗体工作浓度为1∶100。VEGF，bFGF,PDGFβ和IGF1蛋白的表达以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。用病理图象分析系统计算MI边缘区心肌每100×视野中平均灰度值。每张切片随机测定6个视野，取其均值作为该大鼠的灰度值。
　　统计学方法数据用 For Windows统计分析软件处理，计算所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
　　2 结果
　　一般组织形态学观察假手术组可见毛细血管增生不明显；模型组可见少量毛细血管增生；麝香保心丸组可见较多增生的毛细血管；丹参注射液组可见明显增生的毛细血管。
　　各组大鼠MI边缘区MVC和MVD比较假手术组、模型组、麝香保心丸组及丹参注射液均可看到新生的微血管，在显微镜下计数各组大鼠MI边缘区MVC和MVD后，结果显示：与假手术组相比，模型组、麝香保心丸组及丹参注射液MVC和MVD均明显增多；丹参注射液组、麝香保心丸组MVC和MVD较模型组明显增多；而丹参注射液组和麝香保心丸组作用相似。结果见表1。表1 各组大鼠MI边缘区MVC，MVD的比较
　　各组大鼠MI边缘区VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表达及其灰度值光镜下，VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1的阳性染色呈棕黄色，阳性区域主要分布于心肌细胞胞浆。模型组VEGF，bFGF,PDGFβ和IGF1蛋白阳性染色范围较小；假手术组正常心肌细胞中可见少量弱阳性表达，呈不规则黄褐色点状物；模型组明显多于假手术组；麝香保心丸组4种蛋白阳性染色范围大，4种蛋白表达明显多于模型组；丹参注射液组VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白阳性染色范围较大，表达明显多于模型组，IGF1蛋白阳性染色范围较小，表达少于模型组。灰度值见表2。表2 各组大鼠心肌梗塞边缘区VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表达的灰度值
模型组VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表达及其灰度值明显高于假手术组；丹参注射液组VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白表达灰度值较模型组明显增高，IGF1蛋白表达灰度值低于模型组，两组相比无统计学意义；丹参注射液组VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表达灰度值低于麝香保心丸组，两组相比有统计学意义。
　　3 讨论
心脏冠脉侧枝循环的形成和开放能减轻心肌缺血、防止细胞坏死、预防和延缓缺血性心肌病的形成、改善病人的临床症状和预后，而血管新生可促进缺血周边组织侧枝循环建立。MVD是普遍采用的能够反映血管新生强度的有效指标。目前认为CD34是较特异和敏感的生长中的血管内皮细胞表面标志，并且有较强的可重复性［3］。新近报道显示，CD34显示血管内皮细胞时其特异性最高，优于内皮细胞的其他标记物［4］，故本研究采用抗CD34单抗来检测大鼠心肌组织切片中血管内皮细胞CD34表达状况，用以反映血管新生状况、显示和计算MVC和MVD。本研究显示，大鼠MI后，MI边缘区CD34表达增强，MVC，MVD明显增加，这表明心肌缺血以后，启动了血管新生的过程，使缺血心肌新生血管增加以改善供血。分子生物学研究表明，心肌缺血缺氧时的血管新生均是通过生长因子的作用而引起的［5］。以VEGF，bFGF为最重要，PDGFβ和IGF1也参与了血管新生的过程。心肌缺血缺氧时，VEGF和bFGF及受体的表达增强［6］。本研究也发现，模型组VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1蛋白表达及灰度值明显高于假手术组，提示缺血缺氧可诱导VEGF，bFGF,PDGFβ，IGF1的表达。
丹参注射液是从丹参中提取的酮类化合物。研究表明［7～9］，该药有保护缺血心肌、预防冠状动脉形成术后再狭窄、改善微循环、改善血流动力学、调节脂质代谢等作用。本研究显示，丹参注射液能使大鼠MI边缘MVC，MVD明显增加，与麝香保心丸作用相似，表明该药有促进或诱导缺血心肌血管新生的作用。本研究还显示，丹参注射液可促进MI后大鼠缺血心肌VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白的表达，对IGF1的表达则无明显的促进作用，其促进VEGF，bFGF,PDGFβ蛋白的表达作用不及麝香保心丸。通过4种生长因子蛋白表达的测定，发现其表达水平与促血管新生的水平大体上是一致的，提示丹参注射液促血管新生作用与上调VEGF，bFGF,PDGFβ的表达有关。有报道，麝香保心丸有促MI后大鼠缺血心肌血管新生及促VEGF，bFGF表达的作用［10］，故选该药作为对照，结果与报道相一致，而且发现其促血管新生作用还可能与促进PDGFβ，IGF1表达有关。尽管丹参注射液能上调VEGF，bFGF,PDGFβ的表达，但其机理是什么，用药时间多长为宜，最佳有效剂量是多少，均有待进一步深入研究。
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