结肠炎模型.doc

结肠炎（UC）模型得建立及药物得治疗测定
DSS就是一种有蔗糖合成得，有抗止血与抗凝血作用得肝素样硫酸多醣体。BALB/c鼠得遗传背景为近交系，由亲兄弟姐妹遗传繁殖，因而它们之间得个体差异就小，遗传基因更纯，整体素质更好。采用在蒸馏水中加入DSS制成5%DSS溶液给予小鼠自由饮用造模。
一、确定DSS得最适浓度
实验材料：BALB/c小鼠6只，全就是雌性。8-10周左右，体重约为25-30g、
实验试剂：葡聚糖硫酸钠（DSS）（MW=40000），配制成4%得浓度溶液。
实验仪器：电子天平，生物显微镜，微量移液器，枪头。
实验方法：将小鼠随机分为3组，每组2只。分别为 正常对照组，4%DSS浓度组。
二．实验步骤
1. 将6只小鼠正常喂养5天。
2、 5天以后，正常对照组继续正常饲养，但4%DSS浓度组分别喂养配置好得4% 溶液10ml。（一日/一次，连续7天，7天内每天同一时间测量小鼠体重，粪便，便血情况，并进行活动指数评分。）建模期间控制小鼠得食量。
疾病活动指数（DAI）得评估
每日观察小鼠得体重、大便性状与隐血情况，按表1进行评分。将体重下降、大便性状与隐血情况得评分相加，得出每只小鼠得DAI，以评估疾病活动情况。
表1 DA I 评分标准
体重下降（%）
大便形状*
大便隐血/肉眼血便
计分
0
1~5
6~10
11~15
>16
正常
松散
稀便
正常
隐血阳性
肉眼血便
0
1
2
3
4
*正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛门得糊状、半成形大便；稀便：可黏附于肛门得稀水样便。
硫酸甲氨基酚法进行大便隐血试验
（试剂:①10g/l硫酸甲氨基酚乙酸溶液:称取硫酸甲氨基酚1g，溶于40ml蒸馏水中，加冰乙酸30ml溶解，蒸馏水加至100ml混匀 。放入棕色瓶中避光保存，如有变色则应重新配制。②3% 过氧化氢溶液。
方法:取少许粪便涂于玻片中央，滴加10g/l硫酸甲氨基酚乙酸溶液3滴，及3% 过氧化氢溶液3滴混匀，立即观察结果。
阴性(-):3分钟后不出现玫瑰红色或樱红色
(+):30~60秒钟内显玫瑰红色或樱红色;
强阳性(++):立即显玫瑰红色或樱红色;
最强阳性(+++):立即显深玫瑰红色或深樱红色;
隐血试验注意事项:
1、3%过氧化氢易失效，用前滴加在血膜上，有气泡产生方可应用。
2、禁止使用铁、铜、叶绿素剂、碘化钾、溴化物等药物后检验。
3、试验用具应加热处理，以破坏污染得过氧化酶。
4、标本采集立即送检，并应从便表面与内部挑取两处粪便进行检验。）
2. 组织学损伤得得评估
实验第8天用浓度1%戊巴比妥50-60mg/kg腹腔注射麻醉，眼球取血，离心，取血清。剖腹，观察结肠外观取肛门至回盲部得结肠，并测量结肠得长度。沿肠系膜边缘纵行剖开，在解剖镜下观察结肠大体形态。每只小鼠于有严重炎症或溃疡处取标本2cm得结肠组织置于10%中福尔马林浸泡固定，24h后常规石腊包埋、切片 (4u m)，HE染色，观察组织学改变并按表2评分。组织学损伤程度用炎症、病变深度、陷窝破坏评分与病变范围评分得乘积表示。
表2 组织学损伤评分标准
项目
计分
炎症：
无
轻度
重 度
病变深度:
无
黏膜 下 层
肌 层
浆膜 层
隐窝破坏:
无
基底 1 /3 隐窝 被 破 坏
基底 2 /3 隐窝 被 破 坏
仅有 完 整 表 面 上 皮
全部 隐 窝 与 上 皮 被 破坏
病变范围(/%):
1-25
26-50
51-75
76-100

0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
二．造模
实验材料：BALB/c小鼠6只，全就是雌性。8-10周左右，体重约为25-30g、
实验试剂：葡聚糖硫酸钠（DSS），配制成4 %得浓度（MW=40000）（先做预实验，确定DSS得最佳浓度）
实验仪器：电子天平，生物显微镜，微量移液器，枪头。
实验方法：
1、将小鼠随机分为3组，每组2只。分别为 正常对照组，阴性对照组，药物组。
将6只小鼠正常喂养5天。
2. 5天以后，正常对照组继续正常饲养，但阴性对照组、药物组分别喂养配置好得 4% DSS溶液7ml（只）。 （一日/一次，连续7天，7天内每天同一时间测量小鼠体重，粪便，便血情况，并进行活动指数评分。）建模期间控制小鼠得食量。
3. 第8天每组各取1只，眼球取血，解剖，并观察造模情况。(测量标准同上)
同时给阴性对照组与药物组剩下得1只注射药物。（提前计算药物最小致死量）
4、 造模成功后次日给药，正常组与阴性对照组:每天灌喂等体积得生理盐水。阳性药物组：美沙拉嗪20mg/kg，隔天腹腔注射给药。药物低、中、高浓度组每天给药，连续给药7天，每天一次（给药方式为灌胃）。各组小鼠给药期间，观察小鼠体重、皮毛色泽、粪便情况。
5 末次给药24小时后摘取眼球取血，分离血清，测定血清中MPO（过氧化物酶）与NO（一氧化氮）得活性。并处死小鼠，取出肛门至盲肠末端得整个结肠与直肠段，沿肠系膜纵轴剪开，预冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，肉眼观察各组小鼠结肠得大体改变，测量结肠长度及记录湿重。剪取病变最严重得1cm,4%甲醛固定、石蜡包埋、切片。HE染色，观察病理改变，其余结肠至于-80℃冰箱备用。
检测指标与方法
1. 小鼠得体重，粪便，便血，饮食，精神等变化情况。
2. 小鼠血中血红蛋白得含量变化。
3. 小鼠结肠外形及长度得变化。
4. 小鼠结肠组织得生理变化。
（检测方法同上）