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福建农林大学生物工程研究法课程实验方案

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福建农林大学生物工程研究法课程实验方案

发酵工程研究法

学 院: 生命科学学院
专业年级: 07微生物一班
组 长: 李彩斌
指导老师: 孙淑静
小组成员: 马起铝, 李国凡 蓝金莲
叶碧霞 郑梅钦 李彩斌

发酵工程课程实验方案
一、 实验目的
1、 掌握发酵微生物菌种筛选原理和方法
2、 学习和掌握酒精发酵方法和发酵过程的监测方法
3、 掌握酒精对糖和淀粉的转化率的计算方法
二、 实验原理
培养基是供微生物生长、 繁殖、 代谢的混合养料。培养基中一般含有微生物所必须的碳源、 氮源、 无机盐、 生长素以及水分等。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌。发酵成熟醪的成分随原料的种类、 加工方法、 菌种性能不同而不同, 分成不挥发性成分和挥发性成分两大类。许多微生物都能利用已糖化进行酒精发酵, 但在实际生产中用于酒精发酵的几乎全是酒精酵母, 俗称酵母。利用淀粉质原料的酒母在分类上叫啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), 是属于子囊菌亚门酵母属的一种单细胞微生物。该种酵母菌繁殖速度快, 发酵能力即产酒精能力强, 并具有较强的耐酒精能力。
淀粉质原料酒精生产的工艺流程如图所示:

三、 实验材料、 试剂和器材
1、 原料: 玉米粉、 已知酶活力糖化酶
2、 试剂: 氢氧化钠、 盐酸、 硫酸、 DNS、 碘液、 pH4.6的醋酸盐缓冲液
3、 器材: 三角瓶、 试管、 培养皿、 血球计数器
四、 实验步骤
(一) 酵母菌种的分离与筛选
1、 称量50g的从超市中买来的葡萄放置捣烂, 溶于上述的90ml的无菌水中, 振荡30min, 制成原液。
2、 在超净台上, 取1ml原液于9ml装有无菌水的试管中, 摇匀, 制成10-1菌液, 按照同样的方法做成6个稀释梯度, 难后选择4个合适的梯度进行涂平板, 培养基为孟加拉红培养基, 封口, 每个梯度涂布三个重复。
3、 将平板倒置于37℃培养箱中培养3-4d。
4、 观察菌落的生长情况, 选取菌落生长均匀的浓度梯度, 进行划线分离纯化。
5、 在37℃培养箱中在培养3d
6、 选取分离纯化好的单菌落用显微镜进行观察。酵母菌落形态一般大而突起, 边缘可见球状、 卵圆状或假丝状细胞。
7、 挑取鉴定出来的菌落与PDA液体培养基中进行增殖培养。
(二) 酵母产酒精
1、 糊化: 将600ml水加到糖化锅中, 按照料水比1: 4的比例称量玉米粉150g, 调节pH值为5-6, 加入氯化钙(对固形物0.2％), 加入液化酶(12-20U/g淀粉), 在剧烈搅拌下, 先加热至72℃, 保温15min, 再加热至90℃, 并维持30min, 以达到所需的液化程度(DE值: 15-18％), 碘反应呈棕红色。液化结束后, 再升温至120℃, 保持5-8min, 灭酶, 压滤去渣, 降温就能够进行糖化了。
2、 糖化: 液化结束后, 迅速将料液用硫酸将pH调至4.3-4.5, 同时迅速降温至60℃。按照0.6-0.8%/g淀粉的比例加入糖化酶, 搅拌均匀, 放入水浴锅中, 60℃保温若干小时后( 10h左右) , 当用无水酒精检验无糊精存在时。用碘液测定糖化液是否还含有淀粉, 若未完全则继续糖化直至完全为止。注意开始时液面位置并随时补足蒸发掉的水分。糖化结束后, 将料液pH调至4.8-5.0, 同时, 将料液加热至加热90℃, 保温30分钟．然后将料液温度降至60-70℃, 开始过滤。
3、 发酵前还原糖测定: 取一些糖化好的糖化液, 测定其还原糖的含量(用DNS法测定)。
3.1葡萄糖标准曲线制作
取6支试管, 按下表1顺序加入各种试剂。

表1 不同浓度葡萄糖的光密度
试管编号
1
2
3
4
5
6
蒸馏水
3
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
500ug/ml葡萄糖
0
0.5
1
1.5
2.0
2.5
1各加入DNS试剂2.0mL; 2沸水浴加热5min; 3立即用流水冷却; 3定容至25mL;
550nm处测定OD值

最后以葡萄糖含量( mg/mL) 为横坐标, 光吸收值为纵坐标, 绘制标准曲线。
3.2 糖化液还原糖测定
(1)取5ml糖化液进行过滤, 滤液用pH4.6的醋酸盐缓冲液进行稀释, 约稀释10-100倍。
(2)取甲乙两支10ml的试管, 甲试管加入1ml稀释的糖化液, 乙试管加入1mlpH4.6的缓冲液, 分别加入2mlpH4.6的醋酸盐缓冲液和2mlDNS试剂。混匀后沸水浴加热5min, 立即冷却定容到5ml。
(3)混匀分别于550nm处比色, 用乙试管调零, 测3次, 记录光密度值。
(4)然后在标准曲线上查得相应的还原糖含量Gmg。
(5)根据以下公式计算样品中还原糖的含量:
还原糖含量(mg/ml)=Ga( a-稀释倍数, G-还原糖量(mg))
4、 发酵: 将糖化好的糖化液分装于三角瓶中, 每瓶接种约15ml已培养24h的酵母菌, 塞上胶塞( 在加入的时候一定要注意防止杂菌的侵入, 严格使用酒精火保护罐口, 并保持罐内正压) 。
5、 用干布将三角瓶各部分擦干净, 称量初始发酵液的重量, 将发酵液放于30℃的培养箱中发酵, 并于以后每天称量一次, 直至重量减至恒重为止。并用DNS法测定发酵后的还原糖含量。
(三) 酒精发酵液各项指标测定
1、 酒精度测定:
1) 蒸馏: 装好全套蒸馏装置, 取100ml发酵能力较强的发酵液, 放入500ml的蒸馏瓶中, 加入100ml水, 迅速安装到冷凝管上进行蒸馏, 将容量瓶置于冷凝管下端收集馏出液100ml时, 停止蒸馏, 摇匀备用。
2) 将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中, 手持温度计在比重计杆旁, 待温度稳定后, 酒精停稳定时读数, 读数时视线应与刻度计相平。
3) 校正: 根据所量的酒精度和温度、 查表校正为20度时的酒精度。
2、 发酵液还原糖的测定: 方法同发酵前还原糖测定方法一样
3、 酒精发酵液的微生物检查
( 1) 酵母形态的观察
用美蓝染色法取酒精发酵液菌体进行制片, 在放大40倍及100倍的显微镜下观察酵母形态, 用测微尺测量酵母细胞的大小, 并进行死活鉴别。具体步骤如下:
首先, 在载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液, 液滴不可过多或过少, 以免盖上盖玻片时, 溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在发酵液上培养了48小时的筛选出的酵母菌悬液一滴, 放在美蓝染色液中, 使菌体与染色液均匀混合。取盖玻片一块, 小心地盖在液滴上, 不能将盖玻片平放下去, 应先将盖玻片的一边与液滴接触, 然后将盖玻片慢慢放下, 这样能够避免产生气泡。放置3Min。
其次, 将制好的水浸片先用低倍镜观察, 半个小时后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况, 同时能够根据是否染上颜色来区别死活细胞, 因为活细胞的新陈代谢不停地进行着, 因此细胞内氧化还原值(rH)颇小, 而还原力强, 若有无毒的染料进入细胞, 即被还原脱色, 但死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力。美蓝无毒, 且能为活细胞还原成无色, 故可用以区别细胞的死活。但美蓝浓度、 作用时间等均有影响, 应加注意。
（2） 酵母细胞数的测定(酵母耐酒精能力的测定)
1) 取样检测获细胞数目, 用血球计数法: 用适当稀释的酵母菌液, 加到盖有盖玻片的血球计数板上, 根据所数计数格内的细胞数、 加入的菌液量和稀释倍数, 计算出每毫升菌液的含菌量。
2) 耐酒精能力的测试: 配成浓度为0 2% 。。。。。等的水浓液加入等量的扩培过的酵母浓液, 每隔2小时用血球计数板测酵母数目(改成血球计数板测数目)
( 3) 不同酵母菌产酒精能力的测定
本实验主要采用称重法与放出二氧化碳量等测定酵母的发酵能力: 发酵瓶于30℃温箱中进行培养, 每天称重一次, 记录重量, 由于每瓶用于发酵的糖化液体积相同, 因此只需计算出单位时间内CO2释放量, 直至发酵自然停止。以CO2产生量为纵坐标, 发酵时间为横坐标测定CO2产生曲线。
( 4) 不同酵母凝聚性的测定: (采用本斯值法)
将酵母菌在30℃摇床中摇瓶培养36h, 离心弃掉上清夜, 经过无菌水洗涤3次后, 称重1g酵母菌于刻度15ml的离心管中, 注入10ml pH值为4.5的醋酸盐缓冲液, 20℃水浴中放置20min, 摇动离心管5min使酵母细胞重新均匀悬浮, 静置, 记录10min是酵母细胞的毫升数, 即为本斯值, 根据本斯值判断5个酵母菌株的凝聚性强弱。
4、 酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定( 碘量法)
1) 待测酶液的制备
取发酵液的滤液用pH4.6醋酸钠缓冲液适当稀释, 供测定用。
2) 酶活力的测定
于甲、 乙两支管中, 分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml, 摇匀, 在40℃的恒温水浴中预热5-10min, 在甲管中加入待测酶液2ml(酶活总量约100-170单位), 乙管中加2ml蒸馏水作对照, 摇匀, 立即记时。准确反应1h后, 取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应, 冷却至室温。
取上述反应液5m1放入碘量瓶中, 准确加入0.1mol/L碘液10ml, 再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml, 摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1, 用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间, 否则要适当调整酶液的稀释倍数。
3） 计算
糖化酶活力单位的定义: 在40℃、 pH4.6的条件下, 1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

酶活力单位=( A-B)N ×90.05 ×( 1/2) ×( 32.2/5) ×n

式中 A——空白所消耗硫代硫酸钠体积( ml) ;
B——样品所消耗硫代硫酸钠体积( ml) ;
N——硫代硫酸钠浓度( 0.1mol/L) ;
90.05 ——1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质( mg) ;
1/2 ——折算成1m1酶液的量
32.2——反应液总体积( ml)
5 ——吸取反应液样品的体积( ml) ;
n ——酶液稀释倍数。

5、 出酒率、 酒精对糖和淀粉的转化率的计算
将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中, 手持温度计插在比重计杆旁, 待温度稳定后, 酒精停稳时读数。然后根据所量的酒精度和温度、 查表校正20℃时的酒精度。计算解决出酒率
根据葡萄糖发酵生成乙醇的反应式:
C6H12O6 2C2H5OH+2CO2
由于淀粉糖化液中几乎都是可发酵性糖, 可按照上式算糖醇化的理论值。
糖利用率=(实际所得酒精量/理论上所得酒精量)×100%
实际发酵产无水酒精 成熟发酵醪液中含酒精
发酵率%= ×100%= ×100%
理论发酵产无水酒精 发酵液中糖粉% X 0.6479
其中0.6479为发酵糖转化为酒精的转化系数。
淀粉出酒精=(发酵生产中的酒精总量/商品淀粉中的纯淀粉含量)×100%
淀粉利用率=(发酵生产中酒精总量/理论上应得的酒精量)×100%
上式中, 发酵生产出的酒精总量可根据发酵醪和酒精含量估算, 也可利用CO2的产生量计算酒精产量; 一般商品淀粉中纯淀粉的含量为81.12%; 由400g商品淀粉出发发酵生产酒精时, 理论上应得的酒精量约为184g。
( 蓝色的是有问题的或者不大清楚的哈! )

①   葡萄糖发酵生成乙醇的反应式为:
C6H12O6→2C2H5OH+2CO2
v 糖利用率=( 实际所得酒精量/理论上所得酒精量) ×100%
v 淀粉出酒率=( 发酵生产中的酒精总量/商品淀粉中 的纯淀粉含量) ×100%
v 淀粉利用率=( 发酵生产中的酒精总量/理论上应得的酒精量) ×100%