单核细胞增生李斯特菌中CcpA缺失株的构建及对毒力的影响.pdf

CcpA 是革兰氏阳性菌中由 ccpA 基因编码的介导碳分解代谢物阻遏的全局调控因子。近年来的研究表明，CcpA 不仅参与 CC 效应，还直接或间接参与病原细菌毒力基因的表达调控。为探讨 CcpA 对单核细胞增生李斯特菌(Lm)毒力的影响，应用同源重组方法构建 CcpA 缺失菌株。以 BLAB/c 小鼠为实验动物模型，检测野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA 侵染小鼠后的半数致死剂量 LD50和肝脾细菌载菌量，观察小鼠肝脏和脾脏的病理形态变化。结果显示:缺失 CcpA后，Lm 的 LD50降低了 10 倍，虽然肝脾细菌载菌量没有显著变化，但 EGDeccpA 对小鼠肝和脾的损害更为严重，表明 CcpA 缺失增强了细菌的毒力，CcpA 对 Lm 毒力基因的表达可能具有间接或者直接的调控作用。关键词单核细胞增生李斯特菌CcpA毒力半数致死剂量LD50病理形态中图分类号Q789收稿日期:2014-06-18修回日期:2014-06-29*国家自然科学基金资助项目(30970111)通讯作者，电子信箱:qinluo mail ccnu edu cn碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression，CC)是指在混合碳源发酵时，微生物优先利用速效碳源葡萄糖，其分解代谢物对许多基因的表达产生阻遏或激活作用，从而影响非速效碳源利用的现象。在低GC 含量的革兰氏阳性菌中，ccpA 基因编码的分解代谢物控制蛋白 CcpA(catabolite control protein A)是介导CC 效应的主要调控因子1-2。研究表明，CcpA 具有多效性功能，不仅参与 CC 效应，还参与中心碳、氮代谢的调控以及生物被膜的形成等3。在一些致病菌如猪 链 球 菌(Streptococcus suis)、金 黄 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcusaureus)、艰 难 梭 菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)中，CcpA 直接或者间接参与了毒性基因的表达调控4-7。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称 Lm，以下同)属于李斯特菌属(Listeria)，是一种革兰氏阳性兼性厌氧杆菌，广泛存在于土壤、河流、淤泥、粪便、动物饲料等环境中8;通过食用被 Lm 污染的食品或饲料，可引起人和动物的李斯特菌病，造成败血症、脑膜炎、流产和单核细胞增多等多种病症，死亡率高达20%30%，因此，Lm 被 WHO 列为重要的食源性致病菌之一9。Behari 等10 在 1998 年首次成功克隆到 Lm 中CcpA 的编码基因，并证明该基因的功能与 CC 效应直接相关。同时，他们也指出 Lm 的 CcpA 基因序列与其它低 GC 含量的革兰氏阳性菌的 CcpA 基因序列有很高的同源性，暗示 Lm 中 CcpA 也可能参与了毒力基因的表达调控，但是并没有做相关动物毒性实验来验证其功能。本研究运用同源重组方法构建了 ccpA 基因缺失菌株，比较 Lm 野生株 EGDe 和 ccpA 缺失株 EGDeccpA 对小鼠毒力的差异，初步探索 CcpA 在 Lm 中的功能以及在致病机制中的作用。1材料与方法11材料11 1菌株和质粒单核细胞增生李斯特菌野生菌EGDe(血清型 1/2a，ATCC35152，EGD 的衍生株)和质中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 34 No 8 2014粒 pLSV101 均为德国维尔茨堡大学微生物系 WernerGoebel 教授馈赠;DH5 和 pUC18 为本实验室保存;T载体(pMDTM18-T Vector)购自宝生物工程有限公司。112主要试剂PC mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司，T4 连接酶、Xbal、PstI 等酶购自宝生物工程有限公司，细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。BHI 培养基(Brain Heart Infusion)购自美国 BD 公司。113实验动物8 周龄的健康雄性 BALB/c 小鼠由湖北省疾病预防中心提供。114引物表 1 为本实验中所用引物，由上海赛百盛生物工程有限公司合成。根据 NCBI 中 EGDe 基因序列设计引物，在引物的 5端有酶切位点和保护碱基。表 1实验中用到的 PC 引物Table1PC primers used in this studyPrimerSequence(53)P1 ccpA-Eco I-1FCCGGAATTCATTAGGGTATCGTCP2 ccpA-Kpn I-1GGGGGTACCTTGTTTGTAATCAP3 ccpA-Kpn I-3FGGGGTACCTGTCACGCCCGCAACTTTP4 ccpA-Bam H I-4CGTGGATCCACCCTACTTTTAGGP5 ccpA-check-FGTTTTATGCTGAACTTGCTCGTGGGP6 ccpA-check-ATTCTGCCCAAACTTTTACACCTGCP7 ccpA-all-6FCCTCGAGATGGTTGACGTGACGCP8 ccpA-all-6TCGTCGACCCATTTGCGTAATCCTTP9 pUC18-UniTGTAAAACGACGGCCAGTGP10 pUC18-evACAGGAAACAGCTATGACCP11 Lsv3AGTACCATTACTTATGAGCAAGP12 ccpA-4FCGTGTTTTATGCTGAACTTGCTCGTGGGP13 ccpA-4TCGTCTACTTACCTCTACTAGTTTCCAC12方法121ccpA 基因缺失株 EGDeccpA 的构建实验方法参考王莉等11 的报道，首先构建穿梭重组质粒pLSV101-ccpA(C+D)。具体如下:提取 EGDe 总基因组，然后以基因组 DNA 为模板，用引物 ccpA-Eco I-1F/ccpA-Kpn I-1 和 ccpA-Kpn I-3F/ccpA-BamH I-4分别扩增得到 ccpA 基因的上游片段 C 和下游片段 D。EcoI 和 Sal I 分别双酶切 C、D 片段及 pLSV101 载体，T4 DNA 连接酶连接后，转入 DH5 感受态细胞。挑取重组子 DNA，PC(引物 ccpA-Eco I-1F/ccpA-Kpn I-1 和 ccpA-Kpn I-3F/ccpA-BamH I-4)鉴定为阳性的克隆命名为 pLSV101-ccpA(C+D)。然后将 pLSV101-ccpA(C+D)电转入 EGDe 感受态细胞中，37 时pLSV101-ccpA(C+D)整合到 EGDe 染色体上，并进行同源重组交换，交换下的质粒在随后的传代(不加抗生素)中丢失后，利用引物 ccpA-all-6F/ccpA-all-6 进行PC 初步鉴定，获得的 ccpA 缺失菌株最后测序确定。122野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA 的 LD50的测定测定方法参考张再超等12 的工作，首先将野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA 在37 250 r/min 条件下培养到 OD600约为 10 时，分别离心收集细菌，用 PBS清洗 2 遍，然后用 PBS 将细菌悬液进行 10 倍梯度稀释。通过预实验确定野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA 的绝对致死剂量(absolute lethal dose，LD100)和最小致死剂量(minimal lethal dose，MLD)。将梯度稀释后的菌液腹腔注射 8 周龄 BALB/c 小鼠，每个梯度 7只，每只 100l，连续观察 14 d，统计死亡数，计算对小鼠的 LD50。123感染动力学实验参照殷月兰等13 的方法，将8 周龄的 BALB/c 小鼠分成两组，每组 6 只，以腹腔注射途径分别接种 EGDe 和 EGDeccpA 100l(亚致死量)。注射菌液的时间 t=0(day)，分别在 t=2，4，6，8，10，14d 时每组取出 1 只小鼠，在无菌条件下取出其肝和脾，称重，脾全部研磨，肝多点采样称重后进行研磨，用 PBS 梯度稀释 10-2、10-3、10-4，从每一稀释度的组织悬液中分别取 100l，涂布到 BHI 固体培养基上，37条件下培养 10 12h，进行细菌计数，再换算成整个肝、脾中的 Lm 总数。实验重复 3 次，取平均值作为032014，34(8)江黎涵 等:单核细胞增生李斯特菌中 CcpA 缺失株的构建及对毒力的影响其载菌量。12 4小鼠肝脏和脾脏病理形态观测解剖两组中注射最高浓度菌液后死亡的小鼠，迅速对肝脏和脾脏进行无菌取样，并于 10%甲醛溶液固定，进行石蜡包埋切片，HE 染色，光学显微镜下观察肝脏和脾脏病理变化。2结果21EGDeccpA 的构建图 1a 为重组穿梭质粒 pLSV101-ccpA(C+D)的构建结果。该图显示，用 pLSV101 多克隆位点两端的引物 Uni 和 Lsv3 进行 PC 扩增，得到的产物大小与预期的 1105 bp 一致，DNA 测序结果进一步证明了插入的ccpA 基因的 C 和 D 序列正确无误。将构建成功的穿梭质粒 pLSV101-ccpA(C+D)电转入 EGDe 感受态细胞中，经同源重组和抗生素筛选得到的 ccpA 基因缺失菌株。选取预计的缺失片段两侧的碱基序列为引物(ccpA-all-6F/ccpA-all-6)分 别 扩 增EGDe和EGDeccpA。结果如图 1b 所示，以 EGDeccpA 为模板得到的扩增片段比 EGDe 短约 400 bp，其长度与预期一致，表明缺失菌株 EGDeccpA 构建成功。DNA 测序也进一步证实了该结果。图 1EGDeccpA 的构建Fig 1Confirmation of EGDeccpAconstruction(a)Confirmation of the recombinant shuttle vector pLSV101-ccpA(C+D)constructionM:DL5000Marker;1:C fragment;2:Dfragment(b)Confirmation of EGDe ccpA constructionM:DL5000 Marker;1:PC product obtained by using EGDeccpA astemplate;2:PC product obtained by using EGDe as template22野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA 对小鼠半数致死剂量 LD50的测定结果如表 2 所示:野生株 EGDe 的 LD50为 106 23CFU，缺失株 EGDeccpA 的 LD50为 105 52CFU，表明 ccpA 基因的缺失增强了 Lm 对小鼠的毒力，暗示 CcpA 直接或者间接参与了 Lm 毒力基因的表达调控。表 2EGDe 和 EGDeccpA 对小鼠 LD50的测定结果Table 2LD50measurement of EGDe and EGDeccpA for miceDoseEGDe(7 4 )EGDeccpA(39 )CFU/mouse108107106105104103102108107106105104103102Motality7/75/74/73/72/71/70/77/76/75/74/72/71/70/7lgLD506 2355223野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA 对小鼠的感染动力学实验结果腹腔分别注射亚致死量 EGDe 和 EGDeccpA 后，按照既定时间无菌分离得到小鼠肝和脾进行细菌平板计数，结果如图 2 所示。EGDe 和 EGDeccpA 在肝和脾中的变化趋势相同。在开始注射到第 8 天的过程中，肝和脾内的细菌数量均呈上升趋势，并且肝和脾内的细菌含量都较多;在第8 天到第14 天的过程中，两组小鼠中的肝和脾内的细菌含量均明显减少并呈下降趋势。另外，注射后各时间点 EGDe 组的小鼠肝和脾载菌量要略高于 EGDeccpA 组，但该差异无统计学显著性(P005)，暗示缺失 ccpA 基因后 Lm 菌株不仅与野生株一样具有较高毒性，而且这种高毒性可能不与细菌在小鼠脏器中的复制量的高低相关。24腹腔注射野生株 EGDe 和缺失株 EGDeccpA后小鼠肝脏和脾脏病理形态结果如图 3 病理切片结果可知，野生株 EGDe 感染的小鼠肝组织内有大量淋巴细胞浸润，其细胞为圆形或近圆形，细胞形态较一致，核染色质均匀密集深染，肝细胞索状结构紊乱疏松;而缺失株 EGDeccpA 感染的肝细胞核内染色质分散，胞浆及细胞间质稀少且染色浅淡，肝窦明显狭窄，细胞肿胀以致轮廓不甚清晰，细胞恶性程度增大，肝血窦充血明显。同时，野生株 EGDe感 染的小鼠脾脏被膜增厚不明显，组织红髓和白髓界13中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 34 No 8 2014图 2腹腔注射后小鼠肝脏和脾脏中细菌数量的变化Fig 2Bacterial counts in livers and spleens(a)liver(b)spleenThe experiments were repeated for three times图 3腹腔注射后小鼠肝脾组织病理切片分析(HE，400 )Fig 3Pathological analysis for liver andspleen injected by EGDe and EGDeccpA(a)The liver morphology injected by EGDeThe structure of liver cellcords is loose，partial necrosis(b)The liver morphology injected byEGDeccpAThe structure of liver cell cords is disappeared，necrosisincreased(c)The spleen morphology injected by EGDeThe spleniccapsule is not obviously thickened(d)The spleen morphologyinjected by EGDeccpAThe splenic capsule is obviously thickened(e)The spleen morphology injected by EGDeThe structure of spleencells is dense，regularly arranged(f)The spleen morphology injectedby EGDeccpAvacuoles occur in spleen and cells are irregularlyarranged限清晰，淋巴小结结构完整，脾脏结构尚清晰，脾小体、脾窦可分辨;而缺失株 EGDeccpA 的感染造成脾脏被膜明显增厚，组织中淋巴小结的结构被破坏，红髓和白髓的界限不清晰;脾小体增大，单核巨噬细胞增多，呈炎症反应，脾脏淋巴细胞的结构模糊、疏松程度逐渐增加，空泡现象严重。结果表明缺失株 EGDeccpA 对小鼠肝和脾的损害更为严重，毒力更强，与前面测定的 LD50结果一致。3讨论Lm 具有兼性胞内寄生的生活特性，不仅能在巨噬细胞和单核细胞内存活和繁殖，还能突破肠黏膜屏障、血胎屏障和血脑屏障，在肝细胞、脾细胞等多种细胞内存活并繁殖14-16，因此 Lm 的致病机理一直是临床和基础科学研究的热点。但 Lm 毒力基因表达与调控非常复杂，很多调控机制尚待阐明。本实验成功构建了ccpA 基因缺失株，通过小鼠感染模型实验，证明了 CcpA缺失株的 LD50比野生株低了 10 个数量级;病理切片结果也证明缺失株对小鼠肝脾细胞和组织的损害比野生株严重，说明 CcpA 的缺失增强了 Lm 对小鼠的致病性。CcpA 不仅调控细菌的 CC 效应，而且参与多种低GC 含量的革兰氏阳性病原菌毒力基因的表达调控。研究发现，在猪链球菌(Streptococcus suis)中，缺失CcpA 后，不仅 arcB、sao、eno 和 ofs 等和毒力相关的基因的表达发生了改变，而且猪链球菌荚膜合成相关基因的表达显著下调，缺失株的荚膜厚度明显降低，导致细菌毒性减弱4。与之相反，在 A 群链球菌(group Astreptococcus，GAS)中，CcpA 能直接抑制 GAS 主要毒力蛋白链球菌溶血素(streptolysin S，SLS)的转录，因此，232014，34(8)江黎涵 等:单核细胞增生李斯特菌中 CcpA 缺失株的构建及对毒力的影响缺失 CcpA 后，SLS 的表达增强，毒性显著提高17。Lm 中与胞内感染相关的主要毒力基因 plcB、hly、plcA、mpl、actA 和 prfA 组成染色体上一个9 kb 长的基因簇，称为 Lm 毒力岛 1(LIPI-1)18。目前没有文献显示这些毒力基因的表达与 CcpA 相关，但是我们在实验中发现，CcpA 的缺失使得编码广谱性磷脂酶 C 的 plcB 基因活性增强，因此，CcpA 可能是通过调控 plc B 基因来实现对 Lm 毒性的间接调控，我们今后研究的重点将着重探讨 CcpA 缺失对 Lm 相关基因转录表达的调控以及作用途径。总之，本实验证明了 CcpA 缺失使 Lm 毒力明显增强，CcpA 对 Lm 毒力基因的表达可能具有间接或者直接的调控作用，这对研究 CcpA 在 Lm 中的多效功能具有重要意义，同时也为深入解析 Lm 致病机制提供了依据。参考文献1吴艳，顾阳，任聪，等 微生物分解代谢物控制蛋白 CcpA 的研究进展 生命科学，2011，23(9):882-890Wu Y，Gu Y，en C，et al ecent research on catabolite controlprotein A in microorganisms Chinese Bulletin of Life Sciences，2011，23(9):882-8902 Stlke J，Hillen W Carbon catabolite repression in bacteriaCurrent Option in Microbiology，1999，(2):195-2013 Mendez M，Huang I H，Ohtani K，et alCarbon cataboliterepression of type IV pilus-dependent gliding motility in theanaerobicpathogenClostridiumperfringensJournalofBacteriology，2008，190(1):48-604Willenborg J，Fulde M，de Greeff A，et al ole of 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repression(CC)in gram-positive bacteria Increasing evidences suggest that CcpA not only participate in CC，but also regulatethe expression of virulence genes in pathogenic bacteria directly or indirectly To investigate the effect of CcpA onvirulence of Listeria monocytogenes，CcpA deletion strain was constructed using homologous recombination TheLD50of the wild strain EGDe and EGDeccpA for BLAB/c mice was measured，the amount of bacteria in liver andspleen was counted，and pathological changes of liver and spleen were observed The results showed thatcompared to EGDe，the LD50of EGDeccpA reduced by 10 times，and lesion caused by EGDeccpA in liver andspleen of mice was more severe，indicating that deletion of CcpA enhances bacterial virulence in Lmonocytogenes，CcpA might regulate L monocytogenes，virulence gene expression directly or indirectlyKey wordsListeria monocytogenesCcpAVirulenceLD50檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏殏殏殏Pathological morphology姜老师信箱蛋白质研讨班学员问:姜老师，您好!我是蛋白质分离纯化技术专题研讨班的学员，在纯化一个糖蛋白，使用的是单抗与 CNBr 结合后的亲和层析，洗脱是 0 1M 甘氨酸，盐酸调节 pH 至 2 5，样品用含有巯基乙醇的 5 上样缓冲液煮沸十分钟，但结果显示分子量增加了很多，由 36KD 左右到了 60KD。想向您请教原因。非常感谢!姜老师答:学员你好。你的结果表明柱子没有按照预期结合目标蛋白，而是非特异结合了含量很高的杂蛋白。这个杂蛋白可能来自你的抽提物。你用的是表达蛋白吗?蛋白质研讨班学员问:是 CHO 细胞表达的一个多糖蛋白，用离子交换时确实没出现过这一条带，但用两家公司的单抗做出来都出现了这个结果。如果该条带不是表达的蛋白，也不是抗体的话，它只能是来源于血清了。请问应该如何证明其来源?姜老师答:你的抽提方法需要改进，因为这个高含量杂蛋白基本上可以断定是 BSA，这只需对比一下无细胞的培养基与培养后的提取物的电泳就可以了。一向不主张随便选用单抗柱纯化蛋白，因为如果单抗非常脆弱的话，一次低 pH 处理就会损失很多活性。这样，柱子的性能迅速衰减。制作单抗亲和柱的抗体，如果确定未来采用低 pH 洗脱的话，必须在单抗的筛选步骤时就做好抗体的酸耐受筛选，方可采用。43