呼吸道病原体检测.pptx

呼吸道病原体检测呼吸道病原体检测陆欢平陆欢平 呼吸道感染呼吸道感染n呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统n分为上呼吸道感染和下呼吸道感染上呼吸道感染上呼吸道感染n常见急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病n常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症下呼吸道感染下呼吸道感染n包括急性气管/支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等n由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素呼吸道病呼吸道病原体原体n常见的呼吸道病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次体等n据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起n一种病原体可引起多种临床症状，同一临床表现可由多种病原体引起呼吸道病原体呼吸道病原体n细菌：细菌引起呼吸道感染的机会比病毒少。一旦感染，症状多较严重，定位比较明显，如扁桃体炎、中耳炎、鼻窦炎等。由细菌引起的儿童肺炎往往是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌呼吸道病原体呼吸道病原体n病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等呼吸道病原体呼吸道病原体n支原体、衣原体感染导致的呼吸道感染与其它病原体感染的早期临床表现类似。可能在2-3天后咳嗽的症状会表现比较突出。在小于30岁的年轻人中，肺炎支原体是最重要的下呼吸道病原体非典型呼吸道病原体非典型呼吸道病原体n是指除肺炎链球菌以外的病原体，包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、Q热立克次体(贝纳柯克斯体)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)和副流感病毒(PIV)等非典型呼吸道病原体非典型呼吸道病原体n这些病原体变异快，传播广，由于不易形成长期免疫力而难以预防和控制流感病毒副流感病毒病毒呼吸道合胞病毒腺病毒呼吸道病呼吸道病原体检测原体检测现有的主要方法：n病毒分离培养n抗原检测n抗体检测n分子生物学方法等检测方法的比较检测方法的比较检测方法检测方法优点优点缺点缺点病毒分离培养病毒分离培养特异性高，金标准培养条件要求高、灵敏度低，标本中病原体量少时，易致假阴性。抗原检测抗原检测直接免疫荧光法简便、快速、灵敏度和特异性均较高且可用于疾病的早期诊断需要特异性抗体、荧光显微镜，易受采样限制抗体检测抗体检测 间接免疫荧光法灵敏度、特异性较高对疾病早期诊断没有太大帮助酶联免疫吸附法较快速，批量筛查特异性不高，假阳性多分子生物学方法分子生物学方法灵敏度和特异性均很高操作繁琐，价格昂贵抗体抗体、抗原检测的比较抗原检测的比较抗体抗体IgM检测检测病原体抗原检测病原体抗原检测检测最佳时间一般在感染一周左右病毒感染出现症状后即可检测出临床意义回顾性诊断，适用于疾病中后期的诊断，可用于疾病早期诊断，对患者的治疗有重要指导意义检测灵敏度将包被有不同基质的生物薄片固定在一个反应区中，可同时检测多种抗不同病原体的抗体检测方法一般使用ELISA或者间接免疫荧光法，有非特异性荧光一般使用直接免疫荧光法，几乎没有非特异性反应，敏感性较差nIgMnIgGn机体产生IgM一般需要一周左右的时间，而有免疫缺陷或免疫系统不健全的个体如儿童，特别是3岁以下的小孩，其产生抗体往往需要更久，且抗体产生的水平也较低n若检测的是IgG，则不能很好地区分既往感染和急性感染n因此，抗原检测的方法对婴幼儿和儿童的呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药指导比抗体法更有优势n检测抗体IgM比IgG更有临床意义采样采样抗原检测n拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。伸入距离为从耳垂部到鼻尖长度的一半，一般针对两周岁以下儿童，伸入距离约为拭子绒毛头的长度两倍n拭子伸入后要轻轻捻动拭子转3圈。取样后在一小时之内洗脱到生理盐水中，12小时内送检抗原检测采样抗原检测采样采样采样抗体检测n采样对结果影响较大n非典型感染多为干咳，无痰/少痰n阳性率低（标本问题，病毒颗粒小）n抗原在体内存在时间短抗原检测的劣势抗原检测的劣势九项九项呼吸道感染病原体呼吸道感染病原体IgM抗体检测抗体检测检测原理检测原理n间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果试剂盒组成试剂盒组成组分组分成分和用途成分和用途载玻片检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并包被有针对检测物的特异性抗原，质控品吸附剂羊抗人IgG用来吸附人IgG避免干扰IgM 检测FITC结合物荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，和抗原抗体复合物反应，并显色封闭介质 甘油缓冲液，便于观察磷酸盐缓冲液(PBS)用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫球蛋白和结合物实验步骤实验步骤1n样本的稀释：血清标本与PBS按1:1比例稀释n稀释后的血清加入吸附剂中，彻底混匀。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测实验步骤实验步骤2结果判断结果判断阴性结果荧光图谱阴性结果荧光图谱n军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光；支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色阳性结果荧光图谱阳性结果荧光图谱n腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光病原体病原体形态或荧光模式形态或荧光模式嗜肺军团菌杆状肺炎支原体细胞外围荧光模式立克次体球杆状肺炎衣原体球状腺病毒混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）呼吸道合胞病毒混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）甲型流感病毒混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）乙型流感病毒混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）副流感病毒混合荧光模式（细胞核和胞浆或胞膜）嗜肺军团菌n阴性：荧光弱、少、不规则嗜肺军团菌n阳性：荧光密集，且亮度较好，杆状形态肺炎支原体n阴性：红色细胞周围无或少量荧光，亮度弱肺炎支原体n阳性：荧光占视野50%以上，亮度好，形态为明显的细胞膜或胞浆Q热立克次体n阴性：荧光弱、少、不规则Q热立克次体n阳性：荧光亮度强且数量多，形态典型肺炎衣原体n阴性：荧光弱、少肺炎衣原体n阳性：荧光密集，且亮度较好腺病毒n阴性：荧光弱、少腺病毒n阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个呼吸道合胞病毒n阴性：荧光弱、少呼吸道合胞病毒n阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个甲型流感病毒n阴性：荧光弱、少甲型流感病毒n阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个乙型流感病毒n阴性：荧光弱、少乙型流感病毒n阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个副流感病毒n阴性：荧光弱、少副流感病毒n阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个方法的局限性方法的局限性n抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性n单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集双份样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的明显升高方法的局限性方法的局限性n对患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用此方法评价n质控孔用于检测这种现象方法的局限性方法的局限性n在嗜肺军团菌和Q热立克次体中，有时血清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。当出现这种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了临床实际效果图九联检思考题n质控孔的作用是什么？谢谢！谢谢！