单细胞凝胶电泳.pptx

实验十七 单细胞凝胶电泳技术丁书茂单细胞凝胶电泳技术丁书茂丁书茂单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis,SCGE)，也称彗星试验(comet assay)，是Ostling O和Johanson KJ首次提出，后经Singh等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测DNA损伤、交联和修复的方法。因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学调查等诸多方面。一、实验原理DNA链多为磷酸复合物，在生理条件下DNA的多聚核酸链多呈阴离子状态，当外源性因素（如紫外照射）造成DNA链断裂时，负超螺旋结构变得松散，那么在电场作用下DNA就会以一定速率向正极移动。在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等结构受到破坏，胞内蛋白质、RNA及其它成分均扩散到溶液中，而核DNA由于分子量大而只能留在原位。经碱处理和在碱性电解质的作用后，DNA解旋，损伤的DNA断链及其片段会被释放出来，而在电泳条件下，DNA片段可进入凝胶孔隙发生迁移。由于这些DNA分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向正极移动，形成彗星状的图像。在一定条件下，DNA迁移距离和DNA含量分布与DNA损伤程度呈线性相关。随着DNA损伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部DNA含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。二、实验流程采用碱性SCGE，其基本操作过程包括：1.细胞制取取处于对数生长期的Hela细胞，吹打为单细胞悬液，用PBS调节细胞密度为10105 5-10-106 6 个个/ml/ml。2.细胞染毒染毒组：取1ml细胞悬液加入1010-3-3 M H M H2 2O O2 2 溶液50l，混匀，37 水浴30min；阴性对照组：取1ml细胞悬液加入50l PBS缓冲液，同等条件下水浴30min。3.制片第一层胶：在完全磨毛的载玻片上铺180L质量分数为 1%的正常熔点琼脂糖(NMA)，室温固化10min；可将玻片用吹风机稍微加热，以延缓琼脂糖凝固。第二层胶：取50L 质量分数为0.8%的低熔点琼脂糖（LMA）和30L的细胞悬液，混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使其均匀铺开，4凝固10min；第三层胶：移开盖片，滴加100L质量分数为0.5%的LMA于第二层胶上，加盖片，4凝固10min。4.裂解将制好的凝胶放入冷的裂解液中，4下裂解2小时；裂解液使用时新配(铺完第二层胶后即可配制)90ml lysis solution 10ml DMSO 1ml Triton-X1005.解旋从裂解液中将载玻片取出，在蒸馏水中洗去过多盐，晾干。将新配制的电泳缓冲液倒入电泳槽中，约覆过载玻片0.25cm，盖上盖子，在高pH电泳缓冲液中放置20 min以便DNA解螺旋。6.电泳室温下调节缓冲液液面高低，于20V，200mA下电泳20min。7.中和将 凝 胶 浸 入 0.4M Tris缓 冲 液（pH7.5）中，浸洗 30min。8.染色观察用20g/L的吖啶橙染色35min，用双蒸水洗掉表面的染料，24小时内在荧光显微镜下观察。三 结果观察四 注意事项实验操作均在红光或暗处条件下进行，以避免造成DNA的额外损伤。关键步骤是铺胶，尤其是第一层胶，一定要平整，均匀。若有气泡，用下一层胶填平。配制裂解液时，DMSO为致癌剂，注意安全。用去尖的枪头取Triton-X100五 思考题试分析三层胶浓度不同的原因。试分析影响单细胞凝胶电泳实验结果的因素。