固定化酶在医疗应用.pptx

固定化酶在医疗中的固定化酶在医疗中的应用应用应化应化0701 李洋李洋 酶是一类具有催化功能的蛋白质酶是一类具有催化功能的蛋白质,和化学催化剂相比具有和化学催化剂相比具有反应速度快反应速度快,化学、立体和分子部位选择性好化学、立体和分子部位选择性好,反应条件温和反应条件温和,底物专一性强底物专一性强,可在水溶液和中性可在水溶液和中性pH下操作等优点下操作等优点,同时酶同时酶本身可以被微生物降解本身可以被微生物降解,符合绿色化学的要求符合绿色化学的要求.已在食品、医已在食品、医药、轻工和农业等许多领域得到广泛的应用药、轻工和农业等许多领域得到广泛的应用,但和多相催化但和多相催化过程相比过程相比,酶在能源和化工中的应用还存在如下问题酶在能源和化工中的应用还存在如下问题.(1)酶一旦从细胞中分离出来酶一旦从细胞中分离出来,其活性迅速下降其活性迅速下降,并且在实并且在实际应用中对外界因素非常敏感际应用中对外界因素非常敏感,容易因反应条件的变化和杂容易因反应条件的变化和杂质的毒化作用而失活质的毒化作用而失活.(2)酶的分离和纯化手续繁杂酶的分离和纯化手续繁杂,大规模制备和应用成本较高大规模制备和应用成本较高.(3)酶是溶于水的酶是溶于水的,在水溶液中进行反应在水溶液中进行反应,会导致酶和底物、会导致酶和底物、产物从水中分离的困难产物从水中分离的困难,不利于循环使用不利于循环使用.(4)由于反应产物是酶的排泄物由于反应产物是酶的排泄物,对酶催化反应有抑制作用对酶催化反应有抑制作用,限制了产物浓度的提高限制了产物浓度的提高,因此生产强度低因此生产强度低.酶的固定化技术就是为了克服上述缺点酶的固定化技术就是为了克服上述缺点,使酶催化反应能使酶催化反应能像化学催化剂一样在多相反应过程中稳定操作像化学催化剂一样在多相反应过程中稳定操作,并易于回收并易于回收和反复使用而发展起来的一项酶化学与酶工程技术和反复使用而发展起来的一项酶化学与酶工程技术.一、酶在治疗疾病中的应用一、酶在治疗疾病中的应用 目前药用酶的治疗作用目前药用酶的治疗作用包括包括（1）由于体内有害物质的积累所引起的疾病，可以用酶来消）由于体内有害物质的积累所引起的疾病，可以用酶来消除毒物。例如：用脲酶来消除血液中过量的尿素。除毒物。例如：用脲酶来消除血液中过量的尿素。（2）由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所产生的疾）由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所产生的疾病，可以用酶来调整作用，或者补充酶量。如，用苯丙氨酸病，可以用酶来调整作用，或者补充酶量。如，用苯丙氨酸羟化酶可以治疗先天性缺苯丙氨酸羟化酶的苯基酮尿症患者。羟化酶可以治疗先天性缺苯丙氨酸羟化酶的苯基酮尿症患者。（3）癌细胞内异常的生化环境可用酶来破坏，以杀死癌细胞。）癌细胞内异常的生化环境可用酶来破坏，以杀死癌细胞。（4）由于细菌、病毒引起机体产生的疾病，可以用抗生素抑）由于细菌、病毒引起机体产生的疾病，可以用抗生素抑制微生物代谢所需要的酶，使微生物死亡，从而恢复人体健制微生物代谢所需要的酶，使微生物死亡，从而恢复人体健康。康。但是目前，酶治疗中遇到下列几个难题：但是目前，酶治疗中遇到下列几个难题：（1 1）外源酶具有抗原性，注入人体后易产生过敏反应。）外源酶具有抗原性，注入人体后易产生过敏反应。（2 2）外源酶进入人体后极易被蛋白酶水解，被抑制剂抑制，）外源酶进入人体后极易被蛋白酶水解，被抑制剂抑制，因而在体内的半衰期很短。因而在体内的半衰期很短。（3 3）外源酶进入人体后如何集中到发病部位以达到最高疗效。）外源酶进入人体后如何集中到发病部位以达到最高疗效。为了解决以上难题，采用了固定化酶的方法为了解决以上难题，采用了固定化酶的方法。药用酶的固定化提高了其稳定性及缓释性、并可药用酶的固定化提高了其稳定性及缓释性、并可除去免疫原性除去免疫原性.前列腺素衍生物是药物在前列腺素衍生物是药物在20世纪的世纪的重要发现之一重要发现之一,用大孔径用大孔径N2聚氨乙基丙烯酰胺为载聚氨乙基丙烯酰胺为载体体,使前列腺素合成酶固定化使前列腺素合成酶固定化,合成前列腺素衍生物合成前列腺素衍生物E1,显示出良好的活性及贮存稳定性显示出良好的活性及贮存稳定性.微囊固定化过微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性,在临床检测在临床检测及卫生防疫方面具有广泛用途及卫生防疫方面具有广泛用途.葡聚糖磁性纳米微葡聚糖磁性纳米微粒固定化粒固定化L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶,具有通过血液注射治疗急性具有通过血液注射治疗急性淋巴白血病的医用前景淋巴白血病的医用前景.超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SOD在清在清除机体代谢过程中产生的过量超氧阴离子方面也发除机体代谢过程中产生的过量超氧阴离子方面也发挥着至关重要的作用挥着至关重要的作用.下面就下面就L-天冬酰胺酶和天冬酰胺酶和SOD的的固定化进行拓展。固定化进行拓展。L-天冬酰胺酶 L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶(E.C.3.5.1.1，L-asparaginase)能能将肿瘤细胞生长所需的将肿瘤细胞生长所需的L-天冬酰胺水解为天冬氨酸天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，影响肿瘤细胞的蛋白质的合成，从而抑制肿和氨，影响肿瘤细胞的蛋白质的合成，从而抑制肿瘤的生长，临床上主要用于治疗急性淋巴性白血病，瘤的生长，临床上主要用于治疗急性淋巴性白血病，其有效率为其有效率为6O%左右。但直接使用游离的左右。但直接使用游离的L-天门冬天门冬酰胺酶存在着一些缺点：存在较多的副作用，可引酰胺酶存在着一些缺点：存在较多的副作用，可引起急性胰腺炎、胃肠道反应、肝功能和其它代谢异起急性胰腺炎、胃肠道反应、肝功能和其它代谢异常及过敏反应常及过敏反应；游离酶稳定性较差，易被蛋白酶水；游离酶稳定性较差，易被蛋白酶水解。这些缺点限制了游离解。这些缺点限制了游离L-天冬酰胺酶的应用，固天冬酰胺酶的应用，固定化定化L-天冬酰胺酶的研究受到了较多的关注。天冬酰胺酶的研究受到了较多的关注。在在37水浴中使海藻酸钠在蒸馏水中融化，水浴中使海藻酸钠在蒸馏水中融化，加入一定体积的酶溶液，吸入注射器内，逐加入一定体积的酶溶液，吸入注射器内，逐滴滴入磁力搅拌下的滴滴入磁力搅拌下的2%氯化钙溶液中，即可氯化钙溶液中，即可形成光滑的微球体。形成光滑的微球体。4下硬化下硬化2 h，用去离，用去离子水洗涤。再用一定浓度的戊二醛交联子水洗涤。再用一定浓度的戊二醛交联2 h，然后用大量的去离子水洗涤直到无戊二醛为然后用大量的去离子水洗涤直到无戊二醛为止止(加入奈氏试剂检测加入奈氏试剂检测)即得固定化酶。取即得固定化酶。取0.2 mI 游离酶或游离酶或1.5 g固定化酶，加入固定化酶，加入0.8mI 不同不同pH 值值(6.09.0)的缓冲液，再加入的缓冲液，再加入2.0mI 的的L一天冬酰胺溶液一天冬酰胺溶液(0.04 mol/mI)，测定酶，测定酶活力，结果如图活力，结果如图1所示。所示。从图从图1中可以看出，固定化酶的中可以看出，固定化酶的最适最适pH 值为值为85，与游离酶的，与游离酶的最适最适pH 值相比没有发生偏移。值相比没有发生偏移。影响固定化酶最适影响固定化酶最适pH值的因素主值的因素主要有两个，一是扩散效应，另一要有两个，一是扩散效应，另一个是载体带电性质。可能是由于个是载体带电性质。可能是由于采用了带负电荷的载体，载体带采用了带负电荷的载体，载体带电性质产生的影响和扩散效应产电性质产生的影响和扩散效应产生的影响相互抵消，使得固定化生的影响相互抵消，使得固定化酶的最适酶的最适pH 与游离酶相比没有与游离酶相比没有大的改变。大的改变。同理对固定化酶和游离酶的米氏常数，最适同理对固定化酶和游离酶的米氏常数，最适反应温度以及半衰期进行测量比较，发现反应温度以及半衰期进行测量比较，发现2者者基本一致，说明酶的固定化对其活性未产生基本一致，说明酶的固定化对其活性未产生较大影响较大影响.超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SOD SOD即超氧化物歧化酶即超氧化物歧化酶,是人体细胞代谢不可缺少的活性是人体细胞代谢不可缺少的活性蛋白酶。超氧化物歧化酶是一种金属酶。人们在研究中发现蛋白酶。超氧化物歧化酶是一种金属酶。人们在研究中发现超氧化物歧化酶是机体代谢所产生的有害物质超氧阴离子自超氧化物歧化酶是机体代谢所产生的有害物质超氧阴离子自由基的天然清除剂。机体在代谢中产生的自由基以氧自由基由基的天然清除剂。机体在代谢中产生的自由基以氧自由基对机体的危害最大。氧自由基包括超氧阴离子自由基、羟基对机体的危害最大。氧自由基包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢及单线态氧等自由基、过氧化氢及单线态氧等,这些自由基是机体正常代这些自由基是机体正常代谢产物谢产物,尽管它们在代谢中连续不断的产生尽管它们在代谢中连续不断的产生,但由于机体中存但由于机体中存在防御系统在防御系统,所以正常情况下危害不大所以正常情况下危害不大,其中的超氧阴离子自其中的超氧阴离子自由基就可以被由基就可以被SOD清除。研究表明清除。研究表明,SOD对人体血栓症、动对人体血栓症、动脉硬化症、糖尿病等疾病有一定的预防和辅助治疗作用脉硬化症、糖尿病等疾病有一定的预防和辅助治疗作用,并且并且在抗肿瘤发生、消炎和抗衰老等领域也具有广泛的应用前景。在抗肿瘤发生、消炎和抗衰老等领域也具有广泛的应用前景。SOD是一种含金属的酶是一种含金属的酶,按金属辅基的不同可按金属辅基的不同可分成三种。最常见的一种含有铜锌金属辅基分成三种。最常见的一种含有铜锌金属辅基(Cu、Zn-SOD),主要存在于真核细胞的细胞质中主要存在于真核细胞的细胞质中,也存也存在于高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体在于高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。该酶纯品呈蓝绿色膜间隙中。该酶纯品呈蓝绿色,由由2条肽链组成条肽链组成,每每条肽链含有铜、锌原子各一个条肽链含有铜、锌原子各一个,活性中心的核心是铜活性中心的核心是铜;第二种含有锰原子第二种含有锰原子(Mn-SOD),主要存在真核细主要存在真核细胞的线粒体及原核细胞中胞的线粒体及原核细胞中,也存在于植物的叶绿体也存在于植物的叶绿体基质和类囊体膜上基质和类囊体膜上(纯品呈粉红色纯品呈粉红色,由由4条或条或2条肽链条肽链组成组成);第三种是第三种是Fe-SOD,主要存在于原核细胞中主要存在于原核细胞中,Fe-SOD在高等植物中一般仅存在绿体中在高等植物中一般仅存在绿体中(纯品呈黄纯品呈黄色或黄褐色色或黄褐色,由由2条肽链组成条肽链组成),多数情况下一个二聚多数情况下一个二聚体中含有一个体中含有一个Fe原子。原子。以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，采用固定化的方法以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，采用固定化的方法对超氧化物歧化酶进行优化。并采用邻苯三酚自氧化法测定对超氧化物歧化酶进行优化。并采用邻苯三酚自氧化法测定SOD 的活性。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，在的活性。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，在自氧化过程中，超氧阴离子（自氧化过程中，超氧阴离子（O2-）不断消失又不断生成，）不断消失又不断生成，当达到稳态时，其浓度保持恒定，邻苯三酚的自氧化率呈当达到稳态时，其浓度保持恒定，邻苯三酚的自氧化率呈O2-浓度相性。浓度相性。SOD 能催化能催化O2-发生歧化反应，生成发生歧化反应，生成H2O2 和和O2，从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制程，从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制程度，可反映样品中度，可反映样品中SOD 的含量。实验测定在的含量。实验测定在325 nm 处有色处有色醌类的吸光度变化，反映出邻苯三酚自氧化反应的抑制程度。醌类的吸光度变化，反映出邻苯三酚自氧化反应的抑制程度。O2-在水溶液中是中等强度的还原剂和弱氧化剂，它能迅速在水溶液中是中等强度的还原剂和弱氧化剂，它能迅速参与单电子还原反应，但也能被强氧化剂还原。当强还原剂参与单电子还原反应，但也能被强氧化剂还原。当强还原剂维生素维生素C作为终止剂加到反应体系时，便迅速与作为终止剂加到反应体系时，便迅速与O2-反应，阻反应，阻止自氧化反应的继续进行，为同时测定多样品争取了时间。止自氧化反应的继续进行，为同时测定多样品争取了时间。经检测，固定化超氧化物歧化酶活力可达经检测，固定化超氧化物歧化酶活力可达333 U/g，酶活回，酶活回收率为收率为86.32%，均明显高于其他同类实验（，均明显高于其他同类实验（192 U/g，34%；123 U/g，41%）。）。固定化酶在固定化酶在85高温条件下，活力并没有明显下降，反高温条件下，活力并没有明显下降，反而有微小上升，可能是由于高温使固定化酶的载体更为活跃，而有微小上升，可能是由于高温使固定化酶的载体更为活跃，空间位阻变小，更有利于酶与底物的结合。固定化酶在强酸、空间位阻变小，更有利于酶与底物的结合。固定化酶在强酸、强碱条件下活性维持得更久，但在强碱条件下活性维持得更久，但在2 h 后也会降低至后也会降低至50%以以下。在较强的酸碱环境下固定化酶比溶液酶稳定，这是由于下。在较强的酸碱环境下固定化酶比溶液酶稳定，这是由于溶液酶在强酸、强碱中，酶与底物的结合位点构象被破坏，溶液酶在强酸、强碱中，酶与底物的结合位点构象被破坏，不能有效地结合底物，表现为活力大幅度下降；而固定化酶不能有效地结合底物，表现为活力大幅度下降；而固定化酶由于载体的保护作用，其结合位点构象较稳定，受酸碱的破由于载体的保护作用，其结合位点构象较稳定，受酸碱的破坏程度降低，表现为耐酸碱能力增强。固定化酶的坏程度降低，表现为耐酸碱能力增强。固定化酶的Km 比溶比溶液酶稍大，显示固定化酶与底物的亲和能力稍有下降。有文液酶稍大，显示固定化酶与底物的亲和能力稍有下降。有文献表明，献表明，Km 值的下降主要由以下因素引起：值的下降主要由以下因素引起：酶分子构象酶分子构象的改变；的改变；微环境的影响；微环境的影响；底物在载体和溶液间存在分配底物在载体和溶液间存在分配效应；效应；扩散效应的影响。扩散效应的影响。此外固定化酶在临床分析中也已得到应用此外固定化酶在临床分析中也已得到应用,如如,SBA一一4JD型尿素氮葡萄糖分析仪的关键部件型尿素氮葡萄糖分析仪的关键部件,是由三种酶复合而成的是由三种酶复合而成的固定化酶膜圈固定化酶膜圈,将它装配在过氧化氢电极上将它装配在过氧化氢电极上,可以通过血液或可以通过血液或尿液中尿素的变化尿液中尿素的变化,检测运动后的疲劳程度检测运动后的疲劳程度.萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶(fire2fly luciferase)可以用来检测三磷酸腺苷可以用来检测三磷酸腺苷(ATP)的含量的含量.三磷酸腺苷是所有生物能量的贮备形式三磷酸腺苷是所有生物能量的贮备形式,也是细胞代谢活动也是细胞代谢活动的能量来源的能量来源,又是萤火虫荧光素酶催化的发光反应中不可替又是萤火虫荧光素酶催化的发光反应中不可替代的专一性底物代的专一性底物.如果保持萤火虫荧光素中氧和酶的数量恒如果保持萤火虫荧光素中氧和酶的数量恒定定,则荧光强度与则荧光强度与ATP浓度呈正相关浓度呈正相关.换言之换言之,借助荧光素发借助荧光素发光反应中光反应中ATP和荧光强度之间精确的数量关系和荧光强度之间精确的数量关系,就能快速而就能快速而准确地监测生物体因生理状态、疾病、细胞数量变动等原因准确地监测生物体因生理状态、疾病、细胞数量变动等原因导致的导致的ATP含量变化含量变化.因此因此,发展基于萤火虫荧光素酶的生物发展基于萤火虫荧光素酶的生物传感器在医学等诸多领域有着现实的和潜在的应用前景传感器在医学等诸多领域有着现实的和潜在的应用前景.谢谢观看谢谢观看 THANKS