抗氧化剂对猪苓菌丝形成菌核的影响.pdf

254 中国医药生物技术 2013 年 8 月第 8 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol,August 2013,Vol.8,No.4 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.003 论著 抗氧化剂对猪苓菌丝形成菌核的影响 邢咏梅，李红莲，郭顺星 【摘要】目的 旨在考察抗氧化剂维生素 C（Vc）及 NADPH 氧化酶抑制剂 apocynin（Apo）在营养琼脂培养基中对猪苓菌丝形成菌核的影响，并探讨抗氧化剂对猪苓菌丝形成菌核过程中活性氧产生的影响。方法 将不同体积的 Vc 母液分别加入到灭菌后冷却至 60 左右的麦芽糖琼脂培养基中，使 Vc 在培养基中的终浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10、15 mg/ml。将 Apo 配制成 100 mmol/L 的母液，加入到灭菌后冷却至 60 左右的麦芽糖琼脂培养基中，使其在培养基中的终浓度分别为 10、20、40 mmol/L。通过猪苓菌核生物量来评价抗氧化剂对猪苓菌核形成的影响；利用 NBT 还原法检测猪苓菌核形成过程中菌丝及菌核内活性氧的含量。结果 低浓度（0.5 mg/ml）的 Vc 组能够促进猪苓菌丝生长并促使猪苓菌丝形成菌核，菌核生物量为（1.69 0.06）g/20 g 基质，与不添加 Vc 的对照组菌核生物量为（1.55 0.10）g/20 g 基质）相比，所诱导产生的猪苓菌核生物量无显著性差异（P 0.05）；终浓度为 5.0、10、15 mg/ml 的 Vc 组对猪苓菌丝生长及菌核形成均具有抑制作用。任一浓度的 Apo（10、20、40 mmol/L）均使猪苓菌丝生长明显减缓，并且不能诱导猪苓菌核形成。结论 营养琼脂培养基中生长的猪苓菌丝内氧化应激水平达到一定的水平才可能促使猪苓菌丝向菌核分化；抗氧化剂在一定程度上消除了活性氧，使猪苓菌核形成减少或不能形成。【关键词】猪苓；菌丝；活性氧；抗氧化剂；菌核 中国医药生物技术,2013,8(4):254-258 活性氧（ROS）存在于所有真核生物正常细胞代谢过程中，现已明确低浓度非致死性的活性氧可以作为细胞-信号通路的调节分子，调节各种生理过程1。作为真核细胞型微生物的真菌，其分化发育也与活性氧的产生密切相关。Egan 等2通过研究证实，真菌细胞中的活性氧与细胞的分化直接相关。植物病原真菌由菌丝形成菌核的机制一直倍受研究者们的关注。Georgiou3首先提出了真菌菌核 的形成及分化与氧化应激高度相关，并且发现了 Sclerotium rolfsii 菌核的形成过程伴随着高度的脂质过氧化反应的发生。在随后的研究中，植物病 原真菌菌核的形成被认为是由氧化应激触发形成 的4。生物体内产生的活性氧包括：过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、羟自由基（OH）、超氧自由基（O2）等。药用真菌猪苓菌丝形成菌核过程中是否伴随 ROS 的变化以及抗氧化剂对猪苓菌丝形成菌核的影响值得探讨。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株 本实验所用猪苓采自山西古县北平镇党家山村，由中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员分离鉴定，保存于麦麸琼脂培养基中。1.1.2 试 剂 麦 芽 糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO47H2O、维生素 B1、琼脂粉等购自北京科百奥生物科技有限公司。1.1.3 主要仪器 SP-752 紫外可见光分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；除菌滤器、微孔滤膜（孔径 0.22 m，直径 13 mm）购自北京科百奥生物科技有限公司。1.2 方法 1.2.1 麦芽糖琼脂培养基的配制 培养基由 麦芽糖 20.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO47H2O 0.5 g、琼脂粉 15.0 g、去离子水 1000 ml 配制而成。培养基在高压灭菌前，将初始 pH 调至 5.0。1.2.2 抗氧化剂的添加 将维生素 C（Vc）溶解于去离子水中，配制成 100 mg/ml 的母液，母液经 0.22 m 微孔滤膜过滤除菌后，将不同体积的 Vc 母液分别加入到灭菌后冷却至 60 左右的麦芽 基金项目：国家自然科学基金（31201666）；国际科技合作项目(2011DFA31260)作者单位：100193 北京，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所（邢咏梅、郭顺星）；042400 山西省古县农业委员会（李红莲）通讯作者：郭顺星，Email： 收稿日期：2013-05-07 中国医药生物技术 2013 年 8 月第 8 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol,August 2013,Vol.8,No.4 255 糖琼脂培养基中，使 Vc 在培养基中的终浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10 和 15 mg/ml。将 NADPH 氧化酶抑制剂 apocynin（Apo）溶解于去离子水 中并以超声助溶，配制成 100 mmol/L 的母液，加入至灭菌后冷却至 60 左右的麦芽糖琼脂培养基中，使其在培养基中的终浓度分别为 10、20、40 mmol/L。每组 30 个重复，实验重复 3 次。以不添加抗氧化剂的组为对照组，将培养基倒入直径为 9 cm 的平皿中，每个平皿倒入 20 ml 培养基。1.2.3 培养及接种方法 参照文献5-6中培养猪苓的方法进行。1.2.4 观察猪苓菌丝生长及菌核形成情况 观察猪苓菌丝在培养过程中的生长情况。培养 60 d，用镊子和手术刀片将猪苓菌核取出并称取猪苓菌核鲜重，以不添加抗氧化剂的组为对照组，比较各组猪苓菌核形成的生物量情况。1.2.5 NBT 还原法检测猪苓菌核形成过程中菌丝及菌核活性氧含量 以不添加 Vc 的组为对照组，考察猪苓菌丝形成菌核过程中菌丝及菌核的活性氧含量以及抗氧化剂 Vc 对猪苓菌核发育过程中活性氧含量的影响。按照文献7中方法进行测定，将不同发育阶段的猪苓菌丝或菌核样本（0.1 g）与 1 ml 磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.8）充分混合后研磨匀浆（磷酸缓冲液中含有溶质 0.1 mmol/L EDTA，0.3%w/v Triton X-100 及 4%w/v PVP 聚乙烯吡咯烷酮），4 条件下，15 000 g 离心 20 min 后取上清液 1 ml，加入 2 ml 0.05%氯化硝基四氮唑蓝（NBT）与上清液反应 10 min，4，15 000 g，离心 20 min 后取上清液。在 85 水浴中孵育 5 min，冷却至室温，于波长 580 nm 处测定吸光度，吸光度的值与活性氧的含量成正比。每个样品重复 3 次。1.3 统计学处理 实验结果以 sx 表示，均数比较以 SPSS 10.0 对实验数据进行单因素方差分析，P 0.05）。浓度为 1.0 mg/ml 的 Vc 组(Vc-1)猪苓菌丝生长旺盛，其菌核形成的生物量仅为对照组的 57%（图 1C）；浓度为 2.0 mg/ml 的 Vc 组（Vc-2）猪苓菌丝其菌核形成的生物量仅为对照组的 29%；浓度为 5.0、10、15 mg/ml Vc 组（Vc-5、Vc-10、Vc-15）对猪苓菌丝生长具有不同程度的抑制作用，随着 Vc 浓度的升高，其对猪苓菌丝生长抑制程度增强，Vc-5 组猪苓菌丝生长较缓慢，气生菌丝不发达，外围新生菌丝与接种处周围生长的菌丝之间有明显的空隙（图 1D）；Vc-15 组中的猪苓菌丝呈固缩状生长，气生菌丝不发达（图 1F）；Vc-5、Vc-10、Vc-15 组均不能使猪苓菌丝形成菌核。与不添加抗氧化剂的对照组相比，NADPH 氧化酶抑制剂 Apo（10、20、40 mmol/L）使猪苓菌丝生长明显减缓，并且不能诱导猪苓菌核形成。表 1 抗氧化剂对猪苓菌核形成的生物量的影响（sx）Table 1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass(sx)组别（n=30）Groups（n=30）菌核生物量(g/20g 基质)Biomass of sclertia(g/20 g substrate)Vc-0（对照）Vc-0(control)1.55 0.10 Vc-0.5 1.69 0.06*Vc-1 0.88 0.20*Vc-2 0.45 0.08*Vc-5 0 Vc-10 0 Vc-15 0 Apo（10、20、40 mmol/L）0 注：*：P 0.05；*：P 0.05;*:P 0.05).High concentrations of Vc above 5.0 mg/ml(5.0、10 and 15 mg/ml)inhibited the fungus growth and sclerotial differentiation as well.Each concentration of Apo of 10,20 and 40 mmol/L inhibited P.umbellatus mycelial growth and hindered sclerotial formation as well.Conclusion Reactive oxygen species play an important role in P.umbellatus sclerotial formation in Petri dishes.ROS in mycelia should be accumulated to such an extent to induce sclerotial differentiation from mycelia.Antioxidants of certain concentrations eliminate ROS to a certain extent and decrease the biomass of sclerotia or could not induce slcerotial formation.【Key words】POLYPORUS UMBELLATUS;Hyphae;Reactive oxygen species;Antioxidants;Sclerotia Author Affiliations:The Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry 258 中国医药生物技术 2013 年 8 月第 8 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol,August 2013,Vol.8,No.4 of Education,Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193,China(XING Yong-mei,GUO Shun-xing);Agriculture Committee of Guxian Country,Shanxi 042400,China(LI Hong-lian)Corresponding Author:GUO Shun-xing,Email: Chin Med Biotechnol,2013,8(4):254-258 协会之窗 第七届中国生物产业大会在昆明召开 由我会与中国生物工程学会等 19 家行业协会（学会）联合主办的第七届中国生物产业大会于 6 月 20 23 日在云南省昆明市召开。目前大会已分别在石家庄、长沙、长春、济南、深圳、泰州成功举办六届。在宣传我国生物产业政策，搭建生物成果转化和技术交流平台，促进政府、企业、科研及金融对接，推动我国生物技术产业化、集聚化、国际化等方面发挥了积极有效的作用。大会以“生物资源、产业机遇”为主题，举办了生物产业发展高层论坛、专题论坛、科企合作对接及生物产业融资推介、大型专业展览等活动，以企业、政府、协会、学会、科研院所、高等院校、金融机构等为主体，为国内外从事生物技术和生物产业的研发机构和企业搭建政策研讨、学术交流、产品展示、项目合作、投融资对接等综合性平台，研究国内外生物产业发展中的热点问题，探讨生物产业如何快速发展的政策措施，引导技术、资金和人才等要素更好地向生物产业集聚。国家发改委张晓强副主任在开幕式作重要讲话。讲话指出我国生物产业面临着市场需求扩大的重要机遇，面临着全球经济一体化带来的挑战，正是生物产业抓住机遇，乘势而上的时期，预计生物产业将以 20%的增速继续领跑新兴产业，国家发改委在生物产业领域的下一步工作有如下六点考虑：一是落实好生物产业规划。力争在生物医药、生物医学工程、生物农业、生物环保、生物能源、生物服务等重点领域实现高品质发展、产业链协同发展、国际化发展。二是促进产业集聚发展。以国家生物产业基地和国家级特色产业园区为基础，推动形成一批各具特色、重点突出、创新能力强、产业链协调发展的产业集聚区。要结合生物产业、产品需求，选择最适合各地方特点的发展模式。三是加速技术转化和应用。国家发改委将会同相关部门采取激励创新和强化应用的方式，在继续实施企业创新能力建设的同时，实施强化企业技术集成和成果转化的产业化专项，建设重大新产品区域示范应用中心，支持企业、科研院所、高校建立实质性的长期合作关系，鼓励新产品、新技术的有效应用，探索生物产业发展的新机制。四是促进行业监管政策优化。生物技术的发展要求，要积极推动优化市场竞争的环境，包括扩大医疗保险覆盖范围，规范药品采购行为，发展商业保险，发展商业健康保险，支持临床医学，支持疗效确切、安全性高、价格合理的创新药物优先进入医疗保险。完善生物良种补贴政策，稳步推进非粮燃料的应用，有序开展生物柴油的示范。五是支持企业国际化发展。要积极探索合作新模式，在更高层次上参与国际合作，促进全球最新科技成果以及人才、资本等要素为我所用。在引进来方面，鼓励企业引进重大项目、人才团队、先进技术；在走出去方面，支持生物企业申请国外认证，海外上市公司收购国外企业，加强我国生物产业的设备、技术、产品的推广力度和市场认知度，此外，要在坚持优势互补、互利共赢、共同发展原则基础上，妥善应对保护主义。六是鼓励商业模式的探索。在培育发展生物产业的过程中，一定要把技术路线交由市场和企业来选择，政府则通过试点示范的方法，鼓励企业开展商业模式创新，开拓新的市场空间。企业只有一手抓技术创新，一手抓商业模式创新，才能更好地形成强大的技术竞争力和市场竞争力。