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中草药有效成分对肿瘤细胞的凋亡诱导作用研究进展

　　在凋亡的概念引进之前，抗癌药物杀伤肿瘤细胞的机制一直被认为是通过影响细胞增殖周期的不同时相，从而最终导致肿瘤细胞的坏死。事实上，肿瘤细胞的死亡可以通过凋亡和坏死两个途径。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展紧密相关。越来越多的研究证实，许多中草药具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。本文试从凋亡概念的形成、凋亡的机制、现代医学对凋亡的检测手段、以及中草药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展作一综述。
1 现代医学和中医学对肿瘤细胞凋亡的认识
1965年发育生物学家Lockshin和Willianms首先提出了PCD(Programmed Cell Death，程序化细胞死亡)一词，用于描述蛾幼虫的生理性死亡。1972年Kerr等从形态学的角度描述细胞的生理死亡，并将这种细胞死亡命名为凋亡(apoptosis)［1］。细胞凋亡又称程序性死亡(PCD)。细胞凋亡为形态术语，程序性死亡为功能术语［2］，目前文献中多倾向于细胞凋亡这一术语，认为这种死亡是因外来因素触发了细胞内在的死亡机制，最终导致了细胞自身的死亡。外来因素可能是生理性的，也可能是非生理性的，在组织中凋亡的发生是不同步的。
在体内，凋亡小体一旦形成就被临近的上皮细胞、巨噬细胞或肿瘤细胞吞噬，并在溶酶体内被降解。这一过程中没有细胞内容物的释放，不引起炎症反应，同坏死有明显的区别。凋亡和坏死可以认为是细胞死亡的两个不同的途径［3，4］。通过相差显微镜观察细胞凋亡时发现，细胞从发生凋亡，到形成凋亡小体，整个过程在几分钟内完成［5］。凋亡不但存在于正常组织，也存在于肿瘤组织。目前大多数人认为，肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控的结果，也可能是由于细胞凋亡受阻，或者说是应该发生凋亡的细胞群未发生凋亡的结果。但是研究也发现许多未经治疗的肿瘤组织中存在着自发性的细胞凋亡，推测其机制可能和肿瘤组织的轻度缺血，细胞毒T淋巴细胞浸润，巨噬细胞释放TNFα及内在的凋亡机制被启动等有关［6］。
近年来的研究表明，在控制肿瘤的生长和调节肿瘤对各种治疗如放疗和化疗的反应中，凋亡都充当重要的角色。药物治疗达到一定的剂量可引起肿瘤细胞坏死，而当刺激水平降低时，可能导致肿瘤细胞凋亡。一些中药的有效成分可以引起肿瘤细胞的凋亡，但是其机制尚不清楚。此外，凋亡凋控在分子水平上的发展，尤其发现凋亡受到特定原癌基因的蛋白产物及某些抑癌基因产物等的调控，大大扩展了其在肿瘤学研究上的意义［7～13］。
2 肿瘤细胞凋亡的常用检测方法
细胞形态学观察
透射电镜下的凋亡细胞最具特征性。如肿瘤细胞的体积变小，胞膜突起，胞质浓缩，细胞器结构仍然保留，核染色质呈块状沿核模浓聚，胞浆空泡增多，后期细胞DNA断裂，形成由膜包裹的内有较完整的细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。扫描电镜显示凋亡细胞体积缩小，微绒毛和伪足减少或消失。可见部分细胞表面出现单个或多个泡状突起。突起常位于细胞的一侧，且大小不等，有的球形小体与胞体间连接变窄。
DNA琼脂糖凝胶电泳检测
由于凋亡的肿瘤细胞内核酸内切酶的激活，染色质DNA在核小体间断裂，降解成约180~200 bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段，通过电泳后在UV灯下呈现经典的DNA梯状带。
流式细胞仪检测
流式细胞仪检测的原理是根据凋亡细胞在细胞、亚细胞和分子水平上发生的特征性改变。其中核的改变最具特征性，在流式细胞仪光度计上呈现明显的亚二倍体核型峰的特征。
DNA缺口末端标记测定法(TUNEL)
TUNEL鉴定可以检测凋亡细胞核中的单股和双股DNA断链。原理是TdT酶将外源性的生物素或地高辛标记的dUTP直接连接到凋亡细胞核的DNA断链的末端。该方法灵敏度高，可直接在光镜下观察，可进行定量分析，较适用于石蜡组织切片的测定，因而被广泛应用［14］。但是细胞坏死晚期DNA也被切割成大小不等的片段，也可出现TUNEL标记阳性，所以此法也有其局限性［15］。
3 中药诱导体外培养肿瘤细胞凋亡的基础研究
随着医学的发展，对中草药的研究采取了现代化的手段，发现了中药的某些有效成分及有效组分，并能完成有效成分的分离提取。如人参皂甙、三七甙、仙灵多糖、中药中齐墩果酸、黄芪多糖、云芝多糖、猪苓多糖等具有增强和激活免疫系统功能的作用，有助于机体发挥自身的抗癌作用。中药山慈姑是秋水仙碱的原型药，长春花碱、长春新碱及喜树碱、羟基喜树碱、三尖杉酯碱、半支莲生物碱等均是从中药长春花、喜树果、三尖杉、半支莲等中提炼出来的生物碱，临床上广泛应用这些含有抗癌成分的中药治疗肿瘤，收到了一定疗效。并且许多上述这些有效成分经过大量的实验研究证实具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用［16～２０］。
中药或中西医结合能有效治疗恶性肿瘤，同时能减轻放化疗的毒副作用，已经为大量的临床实践证明。大量的研究发现，一些从中药中提取的生物碱，如汉防已碱、秋水仙碱、华木防己碱，以及小襞胺等能有效地抑制肿瘤细胞生长。深入研究发现，这些生物碱不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖，还有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。此外，对某些临床上运用较多的抗癌中药方剂，如活血化淤、解毒消肿类方剂的研究发现，这些药物也有诱导肿瘤细胞凋亡的作用［21，22］。
一些中药单方或复方可通过提高机体免疫力达到间接杀伤肿瘤细胞的目的。根据中医理论则是通过扶正固本来达到“驱邪”的目的。实验证明，虫药香菇多糖，虫草多糖等能诱生TNF［17］，小柴胡汤，十全大补汤及其中部分中药如柴胡、当归、桂枝、茯苓等均具有诱生TNF、提高TNF活性的能力［18］。而TNF则可诱导肿瘤细胞凋亡的发生。
由于国内外70年代起采用砷剂治疗白血病取得了喜人的进展，近年来对一些有确切疗效的含砷中药制剂及其有效成分的诱导凋亡能力进行了广泛研究。如在民间验方的基础上开发的“癌灵1号(主要含砒霜)”［19］，含硫化砷的中药复方青黛片［20］等在治疗慢性粒细胞白血病或急性早幼粒细胞白血病取得了喜人的效果。陈氏［23］研究发现，氧化砷具有特异性地诱导人白血病细胞NB4凋亡的能力。其机制是通过下调bcl2基因表达，使bcl2/bax比值减少，从而导致氧化砷诱导NB4细胞凋亡，而氧化砷并不影响bax，
bclx，cmyc和p53基因的表达。此外，研究亦证实了三氧化二砷还能快速有效地诱导原代APL(急性早幼粒细胞性白血病)细胞凋亡［24，25］。
莪术是具有活血化淤功能的常用抗癌中草药之一，姜科属植物，性苦辛温，常用于方剂中治疗肝癌、胃癌、白血病、宫颈癌。近年来国内外对其提取物的研究较多。如Bhaumik S等［26，27］研究发现，莪术提取物姜黄可诱导体外培养的了AK5肿瘤细胞(一种大鼠的组织细胞瘤模型)凋亡，从而抑制AK5肿瘤细胞的生长。Kawamori T等［28］则用姜黄处理雄性F344大鼠的结肠癌模型以研究其对肿瘤模型的细胞凋亡调节作用，结果发现姜黄能明显提高肿瘤细胞的凋亡比例。
4 中药方剂血清药理学方法诱导肿瘤细胞凋亡研究
中药方剂具有“天然组合化学库”之称，其作用机理可能是多靶作用，即复方中多种有效成分以低于它们中某一单味治疗量进入人体后，有选择地反复作用于某种疾病的多个直接靶点(治标)和间接靶点(治本)，从而达到治疗疾病的目的［29］。
血清药理学方法是一种研究方法，实验技术，而不是一门学科。其原理是将中药复方制剂通过动物灌胃或人体(健康志愿者)服用，经吸收进入机体血液循环，在达到一定血药浓度后，收集受试动物或人的血液，分离所得血清(血清内含有一定量的该药物成分)，再将此血清加入到体外细胞培养体系，观察其药理作用、分析其所含药物有效成分。此时的血药浓度反映了机体的真实血药浓度。它可排除在体外实验中各种干扰因素
　　影响，比较接近药物的体内环境中产生药理效应的真实过程，避免体外实验得出的错误结论［30］。

杨氏等［21］选用具有化痰散结、活血化淤作用的含蜈蚣、蟾皮、半夏、天南星、三七等的892中药方剂，给纯种新西兰家兔灌胃，通过血清药理学方法成功地诱导了人肝癌细胞的凋亡，在荧光镜下明显出现核碎裂的凋亡小体。证明中药复方亦具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而且这种诱导肿瘤细胞凋亡的作用可以经口服药物在体内实现。何氏［22］等选用含白英、山慈姑、茱苓、蜈蚣、延胡索等7味中药构成的中药复方1号及含白花蛇舌草、莪术、夏枯草、半边莲等6味中药构成的中药2号方剂，分别给纯种新西兰家兔灌胃，取血清诱导培养的人胃癌细胞凋亡。结果发现，1号方剂诱导后的培养细胞，无论是DNA凝胶电泳分析、透射电镜观察、或是流式细胞分析都发现凋亡细胞的特征。
总之，血清药理学的方法比中药粗提物直接体外实验有明显的优势，能够揭示单一中药或者复方在体内代谢过程中活性成分的转化和改变；从而有助于研究中药复方配伍规律和促进中药复方药代动力学研究的深入开展；有助于中药中真正有效部位、活性成分的发现，为新药开发提供科学依据。
5 展望
中草药有效成分对肿瘤细胞的凋亡诱导作用研究仍处于初步阶段。有待进一步研究的问题主要有：(1)目前中草药诱导肿瘤细胞凋亡多为体外实验，体内实验情况相当复杂。如有些中药的有效成分可直接诱导凋亡，有些中药需要通过体内的代谢才能发挥作用，有些则通过刺激机体免疫系统，合成或激活某些细胞因子来产生凋亡诱导作用。后面两种机制的研究受到体外实验的限制。近年来逐渐开展起来的血清药理学方法对中药的药理作用的研究，已形成热点。给抗肿瘤中草药的研究和开发，带来了广阔的前景。(2)许多中草药能直接诱导肿瘤细胞的凋亡，但是目前的文献中，有关其分子机制的研究报道很少。例如中药的有效成分是从哪个环节开始启动肿瘤细胞的程序性死亡(凋亡的)，与何受体有关，是否需要载体的参与，能否在受体水平或受体传递环节上干扰细胞凋亡过程或细胞凋亡调节过程等，都有待深入研究。(3)细胞凋亡是一种主动的受基因凋控的细胞自杀过程，许多基因如p53,Cmyc,bcl2及其相关基因bclx,bax,bad等均参与凋亡的调控。用中草药诱导肿瘤细胞凋亡，是否也有凋亡相关基因的参与，对凋亡相关基因的影响如何，亦有待进一步研究。(4)近年来对单味中草药的抗癌成分研究较多，与西医化疗药的研究有雷同之处。而临床上治疗肿瘤比较有效的多为方剂，是根据扶正、固本、驱邪的中医理论制定的多味中药复方。深入研究中药方剂中各种成分的抗肿瘤机制，有助于进一步发挥祖国传统医药学在肿瘤防治领域的强大作用。(5)中药在肿瘤的放、化疗过程中能减轻其毒副作用，增加患者对放、化疗的耐受性。是否可以通过中药处理，提高肿瘤细胞对放、化疗产生的凋亡诱导作用的敏感性，从而提高疗效或在相同的疗效下减轻放、化疗的剂量，有着现实的研究意义。(6)目前中草药对肝癌或白血病的体外培养细胞株的凋亡诱导作用研究较多，而对于口腔肿瘤细胞模型的凋亡诱导作用罕见报道，且临床上已经证实抗口腔肿瘤有效的中药方剂或单药还是比较多的，有必要在此领域开展深入的研究。
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