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免疫组化原理及步骤
免疫组化操作规程
一、实验原理与意义
免疫组织化学又称免疫细胞化学,就是指带显色剂标记得特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学得呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定得一项新技术。它把免疫反应得特异性、组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋
白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材
微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器与通风橱等。
三、试剂配制
1、 0、01 M PBS(pH 7、34 ):9、0 g NaCl + 50 ml 0、2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;
1000 ml 0、2M PB (pH 7、4)＝5、93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58、02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸
水或＝190 ml A + 810 ml B(A、 0、2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15、6 g in 500 ml ddH 2 O;B、 0、2
M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71、632 g in 1000 ml dH 2 O)。
2、 Citrate Buffered Saline(0、01 M 柠檬酸缓冲液,PH6、0):28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A、Citrate acid(柠檬酸):10、5 g 加双蒸水至 1000 ml;B、Citrate sodium(柠檬酸钠):29、41 g 加双蒸水至 1000 ml)。
3、 细胞通透液:由终浓度分别为 0、3%双氧水与 0、3%Triton X100 混合而成。配制方法就是先用微波加热得 36 ml PBS,再接着加 120 ul TritonX100,并加热一儿,冷却至临用前加 0、4 ml 30％H 2 O 2 。
4、 5％羊血清或封闭血清,用 PBS 稀释。
5、 含 0、03％H 2 O 2 得 0、05％DAB(避光):用 20×DAB(1％,10 mg/ml)5 ul＋0、1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS。
6、 一抗、二抗均用 PBS 稀释。
7、 Xylene、梯度 Ethanol(100％×2、95％、80％、70％、50％)、双蒸水、中性树胶(封裱剂)。
8、 苏木精染液:
四、操作步骤
1 、脱蜡、水化
1) 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes;
2) 100% absolute ethanol:2 ×5 minutes;
3) 95% ethanol 2 minutes;
4) 80% ethanol 2 minutes;
5) 70% ethanol 2 minutes;
6) distilled water:5 min;
7) PBS 洗 3 次×3 min。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
8) 用封闭通透液浸润切片 30 min(RT 避光)。配法就是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX100 加热几分钟后,临用前加 400 ul 30％H 2 O 2 。
9) PBS 溶液洗 3 次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
10) 切片放入 0、01 M 柠檬酸钠缓冲溶液(pH6、0)后,在微波炉里高火 4 min 至沸腾后,再加热约 6 min×4 次,每次间隔补足液体,防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
11) PBS 溶液洗 3 次×3 min;
12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清(与二抗来源一致)后放入湿盒中,室温 30(10～30)min;
5、一抗孵育
13) 甩去切片上得羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清,直接加入已稀释得一抗(1:250、500、1000)后,放入湿盒中室温 1 小时,然后 4 度过夜,从冰箱中取出需37 ℃复温 45 min。
6、二抗孵育
14) 将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次;
15) 用滤纸将圆圈周围得水吸去,加入已稀释得二抗后放入 37 ℃恒温烤箱中 30 min(回收)。
16) 用 PBS 洗 5 次×5 min;
7、SP 反应
17) 加入 SP 后放入 37 度烤箱中 30 min。
18) 用 PBS 洗 5 次×5 min;
8、显色
19) 加入 DAB(快速滴入,观察染色情况,倒掉染液),显色时间控制在约 5 min(3～10 min),由镜下观察颜色控制时间。0、05％DAB(避光)(1:20 储备液):5 ul 20×DAB＋0、1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS。1%DAB 储备液得制:50mgDAB+5ml 0、05 mol/L PBS 充分溶解,20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
20) 用 PBS 3 次×3min 后,用双蒸水洗 5 min;
21) 加一大滴苏木素染液,胞核蛋白染几秒,胞浆或胞膜蛋白染 20 s 后自来水冲洗,
双蒸水洗 5 min,再用 PBS 返蓝 5 min。
22) 脱水:
50% ethanol 12 min,
70% ethanol 12 min
95% ethanol 12 min;
95% ethanol 12 min;
100% absolute ethanol: (12) min;
100% absolute ethanol: (12) min。
23) 透明:Xylene 1×(12) min→Xylene 2×(12) min
24) 封片:中性树胶。
五、注意事项
1、 苏木素复染时间需要摸索,尤其阳性染色也在细胞核上。
2、 DAB 显色时间需要达到最优化,镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。
3、 抗体孵育时间与抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。
4、 切片脱蜡与水化要充分;加反应液时要覆盖组织充分;每次加液前甩干洗涤液,但又防止干片;用组化笔画圈时尽量画大一点,否则墨水排斥液体,引起片周边干片。
5、 片子着色不均匀得原因如下:
① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min,立即放入新鲜得 xylene1;
② 水化不全。应经常配制新鲜得梯度乙醇;
③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂;
④ 抗体孵育时,切片放倾斜;
⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。
⑥ 制片厚薄不均匀等问题染片盒不平,切片倾斜。
6、 一抗从 4 ℃拿出后,为什么有人说要 37 度复温,目得就是什么？
① 一方面,防止切片从 4 ℃直接放入 PBS 易脱片; ② 另一方面,使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱得抗原可能有用,4 ℃与 37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率与运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
7、切片染色后背景太深,不易区分特异性与非特异性着色？
① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制;
② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色,建议试用单克隆抗体瞧瞧;
③ 内源性过氧化物酶与生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高,需要通过延长灭活时间与增加灭活剂浓度来降低背景染色;
④ 非特异性组分与抗体结合,这需要通过延长二抗来源得动物免疫血清封闭时间与适当增加浓度来加强封闭效果;
⑤ DAB 显色时间过长或浓度过高;
⑥ PBS 冲洗不充分,残留抗体结果增强着色;
⑦ 标本染色过程中出现干片,易增强非特异性着色。
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