金花茶种子对激素相关性肿瘤体外抑制作用的实验研究.pdf

身行为的过程,记忆是指获得的信息或经验在脑内贮存和提取(再现)的神经活动过程,二者密切相关 3,4。学习和记忆是以行为反应作为测量指标的。因此,本实验选用此方法检测大鼠的空间学习、记忆能力的改变在 morris水迷宫测试中,药物组与模型组相比潜伏期缩短、穿台次数增加,说明沙棘水提物对阿尔茨海默病大鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用。表 4?沙棘对阿尔茨海默病大鼠脑组织 MDA含量的影响(?x?s)nmol mg-1组别MDA正常5.4?0.42模型7.77?1.09药物6.83?0.52*药物对照5.63?0.43*?与模型组比较,*P 0.05,*P 0.01;n=10近年来研究结果表明,AD 患者脑组织 SOD 活性降低及MDA含量增高等证据,说明自由基与 AD的发病关系密切。SOD具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力的功能。SOD这种酶是自由基损害的主要防御酶,对自由基的毒性具有保护性作用 5 7。本实验结果显示,与阿尔茨海默病大鼠模型组相比,药物各剂量组脑中 SOD活性均显著增高,提示沙棘能提高机体抗自由基氧化的功能。MDA是体内自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的主要代谢产物,对细胞具有严重的损伤作用,常被用来间接反映机体的自由基代谢变化。MDA进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联,生成无活性脂褐质,沉积于组织细胞,破坏细胞膜结构,最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡 8,9。因此,自由基导致的脂质过氧化、细胞破裂和退行性病变与阿尔茨海默病有着密切的关系。本研究的结果显示,沙棘组脑中的 MDA 含量低于模型组,由此推断,沙棘通过对大鼠大脑组织中 MDA含量的抑制可减轻阿尔茨海默病模型大鼠机体组织细胞的脂质过氧化程度。沙棘的此种作用与沙棘的化学成分如黄酮、萜类、甾体类、维生素类、蛋白质和氨基酸类、挥发油和脂肪酸类、有机酸类、糖及微量元素等在心、脑血管系统疾病具有显著的药理作用,以及清除人体内的自由基和抗衰老的作用有关。因此,本研究认为沙棘对阿尔茨海默病大鼠可以改善其学习记忆能力,其作用机制可能与抗自由基损伤,防止脂质过氧化作用有关。其作用机制方面还有待于今后深入的研究。参考文献:1?齐虹凌,于泽源,李兴国,等.沙棘研究概述 J.沙棘,2005,18(2):37.2?廉永善,陈学林.沙棘属植物天然产物化学成分的时空分布 J.西北师范大学学报(自然科学版),2000,36(1):113.3?Baoru Yang,H eikkiKa llio.Composition and physiological effects of sea?buckthorn(hippophae)lipids J.Trends in Food Science&Techno lo?gy,2002,13:160.4?Vahid Bila loglu Guliyeva,Mustafa Gulb.H ippophae rhamnoides L.chro-matogmphicmethods to deter m ine chem ical composition,use in tradi?tionalmedicine and phar macological effects J.Jour nal of Chromatog?raphy B,2004,812:291.5?程体娟,卜积康,武莉蔚,等.沙棘籽油的保肝作用及其作用机理初探 J.中国中医药杂志,1994,19(6):367.6?S Geetha M,SaiRam.Anti-ox idant and i mmunomodulatory propertiesof seabucktron(hippophae rhamnoides)-an in vitro study J.Journalof Ethnophamacology,2002,79:373.7?于晓莉,潘雨利,侯永坤,等.沙棘提取物抗老龄鼠衰老作用的实验研究 J.白求恩医科大学学报,2001,27(5):501.8?Bohnen N I,KauferD I,Ivanco LS,et a.l Certical cholinergic function ismore severely affected in parkinsonian dementia than inA lzhe i mers dis?ease:an vivo position emission tomographic study J.Arch Neuro,l2003,60(12):1745.9?Jang I,Jung K,Cho J.Age-related changes in antiox idant enzymeactiv ities in the s mall intestine and liver from W istar rats.Exp Ani m.1998,47(4):247.收稿日期:2009?01?13;?修订日期:2009?08?03作者简介:韩立春(1974?),女(汉族),吉林长春人,现任吉林省肿瘤医院主治医师,硕士学位,主要从事恶性肿瘤的防治研究工作.*通讯作者简介:王永奇(1946?),男(汉族),吉林长春人,现任大连大学生物工程学院教授,博士学位,主要从事天然药物化学的研究工作.金花茶种子对激素相关性肿瘤体外抑制作用的实验研究韩立春1,史丽颖2,于大永2,唐?前2,唐?玲2,冯宝民2,王永奇2*(1.吉林省肿瘤医院,吉林 长春?130012;?2.大连大学药物研究所,辽宁 大连?116622)摘要:目的 观察金花茶种子不同提取物对激素相关性肿瘤体外抑制作用。方法 采用噻唑蓝比色法(MTT)检测金花茶种子不同提取物对人宫颈癌 HeLa S3细胞和人前列腺癌 PC3细胞增殖的影响。结果 金花茶种子乙醇提取物、正丁醇部分和水溶部分都显示了较强的抑制人宫颈癌 HeLa S3细胞和人前列腺癌 PC3 细胞增殖的作用,其 IC50分别为 85.88,67.62,55.71?g/ml和 63.06,56.20,68.53?g/m,l且抑制作用和样品浓度呈量效关系。结论 金花茶种子乙醇提取物的正丁醇部分和水溶部分在体外对激素相关性肿瘤具有抑制作用,为其抗癌活性的有效部位。关键词:金花茶;?宫颈癌;?前列腺癌;?HeLa S3细胞;?PC3细胞中图分类号:R285.5?文献标识码:A?文章编号:1008?0805(2009)12?3146?02Inhibitive Effect of Seeds of Camellia chrysantha(Hu)Tuyama on Gonadal Hor monesDependent Tumour in vitroHAN Li?chun1,SHI Li?ying2,YU Da?yong2,TANG Qian2,TANG Ling2,FENG Bao?m in2,WANG Yong?qi2*(1.TheTumorHospital of Jilin Province,Changchun,130012,China;2.Phar macological Institute,DalianUniversity,Dalian 116622,China)Abstract:Objective To investigate the inhibitive effect of the seeds ofCamellia chrysantha(Hu)Tuya ma on GonadalHor?3146 时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期LISHIZHEN MEDICI NE AND MATERI A MED I CA RESEARCH 2009VOL.20 NO.12mones dependent tumour in vitro.M ethods HeLa S3 cellswere cultivated inRP M I 1640medium containing 10%fetal calf ser?um,PC3 cellswere cultivated in DMEM medium containing 10%fetal calf serum.The anti-proliferative effect of the seeds ofCamellia chrysantha(Hu)Tuya ma onHeLa S3 cells and PC3 cells were analyzed byMTT assay.Results EtOH extract,BuOHfraction andH2O fraction from the Et OH extract fro m the seeds ofCamellia chrysantha(Hu)Tuyama could significantly inhibitthe proliferation ofHeLa S3 cells and PC3 cells at I C50concentration of85.88,67.62,55.71?g/ml and 63.06,56.20,68.53?g/m,lrespectively and a dose-dependent relationship bet ween inhibitive ability and sample concentration.Conclusion BuOHfraction andH2O fraction fro m theEtOH extract from the seedsofCamellia chrysantha(Hu)Tuya ma are effective for anticancer.Key words:Camellia chrysantha(Hu)Tuya ma;?Cervical cancer;?Prostatic cancer;?HeLa S3 cells;?PC3 cells?金花茶 Camellia chrysantha(Hu)Tuyama系山茶科 Theaceae山茶属 Camellia L inn.金花茶组 Section chrysantha Chang植物,被列为国家一级、世界二级珍稀保护植物 1。金花茶不仅有较高的观赏价值,而且具有一定的药用价值和营养价值。其叶和花为壮族民间用药,主要用于治疗咽喉炎、痢疾、高血压病、便血、月经不调 2,3。金花茶叶是一种含有丰富营养成分的山茶,含有多种微量元素和氨基酸,而咖啡碱含量低4。我们在对山茶属植物抗肿瘤活性的研究中发现,金花茶种子的乙醇提取物具有较强的抗肿瘤作用。本研究将通过考察金花茶种子乙醇提取物不同萃取部位对人宫颈癌 HeLa S3细胞和人前列腺癌 PC3细胞增殖的影响,探讨其抗癌活性的有效部位及量效关系。1?材料与方法1.1?金花茶的提取分离 金花茶种子采集于广西南宁,由广西林业科学研究院高级工程师梁盛业鉴定。取金花茶种子 100 g,粉碎后用 95%乙醇回流提取 3次,3 h/次,合并提取液,减压浓缩成浸膏,加适量水分散,依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取,各萃取液分别浓缩至浸膏,得醋酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶部分,减压浓缩并真空干燥后得到各部分的浸膏,各浸膏用 DM SO配成各浓度溶液备用。1.2?细胞系和培养液 人宫颈癌 HeLa S3细胞株和人前列腺癌PC3细胞株从 Human SciencesResearchResource Bank(日本人类科学基金会,东京,日本)获得,HeLa S3细胞培养于含有 10%热灭活小牛血清的 RP M I 1640培养液中,PC3细胞培养于含有10%热灭活小牛血清的 D M EM 培养液中,37!,5%CO2,饱和湿度条件下培养。选取对数生长期细胞进行实验。1.3?体外细胞增殖抑制实验 噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞生长情况,将 HeLa S3细胞和 PC3细胞分别种于 96孔培养板,每个孔细胞数为 5 103,分别培养于 RP M I 1640培养液和 DMEM培养液中,在 37!,5%CO2条件下培养 24 h。培养 24 h后,以PBS冲洗细胞,然后分别加入新的培养液和系列浓度的待测样品。经初步筛选后确定实验组设 6个药物浓度组,每组药物的终浓度分别为 5,10,20,40,80,160?g/m,l 对照组加入同样浓度的二甲基亚砜(DMSO),培养 24 h。培养结束前 4 h每孔加入 20m lMTT溶液(5 mg/ml),离心,弃上清液,加入 200 m lD M SO 充分溶解结晶物,酶标仪测 490 nm处吸光度值。因为吸光度值与培养液中活细胞数成正比,所以通过吸光度值可以计算细胞存活百分率。1.4?统计分析 以对照组中细胞存活率为 100%,样品组与其相比所得相对值为细胞存活百分率,实验结果以?x?s表示,采用统计学 t检验进行组间比较分析,P 0.05为差异有显著性。2?结果用浓度分别为 5,10,20,40,80,160?g/m l的金花茶种子的不同提取物处理 HeLa S3细胞和 PC3细胞,观察不同浓度的样品对 HeLa S3细胞和 PC3细胞增殖的影响。结果发现金花茶种子乙醇提取物、正丁醇部分和水溶部分都显示了较强的抑制 HeLaS3细胞和 PC3细胞增殖的作用(见表 1),其 I C50分别为 85.88,67.62,55.71?g/ml和 63.06,56.20,68.53?g/m l。其中,正丁醇部分和水溶部分的高浓度组(160?g/m l)对 HeLa S3细胞和 PC3细胞增殖的抑制率均达 60%以上,且抑制率随样品浓度的加大而增加(各浓度组与对照组相比差异有统计学意义,P 0.01),呈现出剂量效应关系。?表 1?金花茶各提取物对 HeLa S3细胞和 PC3细胞增殖的影响(?x?s)组别浓度 C/?g m l-1HeLa细胞存活百分率(%)PC3细胞存活百分率(%)醇提物全组分(EF)592.82?1.47*95.55?2.66*1093.11?3.81*81.85?4.96*2083.73?1.49*85.27?7.20*40F89.23?2.26*85.86?11.458080.93?3.04*35.38?9.71*16046.50?4.57*22.27?2.53*醋酸乙酯部分(EAF)597.55?1.20102.09?6.761097.13?3.6895.94?2.142097.37?1.7395.55?7.294096.40?14.46102.05?13.5580100.85?8.0799.62?1.52160107.81?7.6494.65?0.76正丁醇部分(nBF)593.10?3.13*89.96?6.841089.79?4.81*87.50?19.282085.33?0.61*91.48?3.13*4082.91?9.81*85.82?4.40*8047.59?12.69*18.28?3.11*16039.38?3.85*17.71?1.60*水溶部分(WF)589.68?3.18*98.09?2.081092.91?0.85*93.11?12.732084.65?1.95*99.83?5.684069.37?2.50*93.50?7.048031.81?2.96*34.78?8.79*16026.99?1.87*26.66?0.59*?与对照组比较,*P 0.05,*P 0.01;n=33?讨论我们采用重组人雌(孕)激素受体基因酵母法对金花茶种子乙醇提取物进行了雌(孕)激素活性试验,证明它们都具有明显的雌(孕)激素活性,同时又有较强的抗雌(孕)激素活性,对雌(孕)激素受体具有双向调节作用,是一种非常理想的选择性雌(孕)激素调节剂 5,6,引发我们对其抗激素相关性肿瘤(GonadalHor monesDependentTumour,GHDT)的研究。因为具有雌激素样作用的药物能直接作用于雌激素受体,通过影响激素平衡来抑制某些激素相关性肿瘤。我们首先考察了金花茶不同植物部位抑制 HeLa S3细胞和PC3细胞增殖的活性,在金花茶种子乙醇提取物、花蕾乙醇提取物、叶乙醇提物和叶水提取物中,金花茶种子乙醇提取物显示了较强的抑制 HeLa S3细胞和 PC3细胞增殖的活性,为了确定其抗癌活性的有效部位,我们考察了金花茶种子乙醇提取物不同萃取部位对 HeLa S3细胞和 PC3细胞增殖的影响,结果表明金花茶种子乙醇提取物的正丁醇部分和水溶部分具有较强的抑制 HeLaS3细胞和 PC3细胞增殖的活性,初步确定为抗癌活性的有效部位。对有效部位化学成分的定量分析结果表明,正丁醇部分含总皂苷 19.08%,总多酚 6.92%,总黄酮 5.36%,水溶部分含总皂苷17.36%,总多酚 5.15%,总黄酮 1.66%,其中哪些成分是抗癌活 3147 LISHIZHEN MEDICI NE AND MATERI A MED I CA RESEARCH 2009 VOL.20 NO.12时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期性的物质基础及其作用机理还有待进一步研究。参考文献:1?梁盛业,陆敏珠.中国金花茶栽培与开发利用 M.北京:中国林业出版社,2005:1.2?黄燮才.金花茶开发利用概况及前景预测 J.中国中医药信息杂志,1994,1(6):10.3?王永奇,吴小娟,李红冰,等.药用山茶属植物的研究 J.大连大学学报,2006,27(4):47.4?韦?霄,蒋水元,蒋运生,等.珍稀濒危植物金花茶研究进展 J.福建林业科技,2006,33(3):169.5?吴小娟,李?剑,刘?芸,等.重组雌激素受体基金酵母法对山茶子抗骨质疏松活性部位的研究 J.辽宁中医药杂志,2008,35(7):126.6?吴小娟,李?剑,刘?芸,等.重组雌激素受体基金酵母法对山茶子拮抗孕激素作用的研究 J.时珍国医国药,2008,19(8):1817.收稿日期:2009?02?15;?修订日期:2009?08?03作者简介:谭?玲(1982?),女(汉族),四川绵阳人,成都中医药大学 2005级在读硕士研究生,主要从事中药分析研究工作.*通讯作者简介:夏厚林(1964?),男(汉族),四川大竹人,现任成都中医药大学药学院教授,博士学位,主要从事中药药效物质基础及质量标准研究工作.三黄片中辅料聚丙烯酸树脂#的质量研究谭?玲,石战英,夏厚林*,董?重,吴远波(成都中医药大学,四川 成都?610075)摘要:目的 将辅料的质量考察加入到制剂的质量研究中,完善三黄片质量的评价标准。方法 采用红外分光光度法,滴定法等多种分析方法,就三黄片中辅料的质量进行深入研究。结果 三黄片中聚丙烯酸树脂 II中甲基丙烯酸单元的含量为 34.0%39.0%。结论 制剂三黄片中辅料聚丙烯酸树脂 II质量稳定。关键词:三黄片;?聚丙烯酸树脂 II;?质量研究中图分类号:R284.2?文献标识码:B?文章编号:1008?0805(2009)12?3148?01?三黄片为中国药典%2005年版&部收载品种 1,具有清热解毒,泻火通便的功效,为临床常用的 OTC药品。现行质量标准的检测项目包括显微鉴别,盐酸小檗碱、大黄薄层色谱鉴别,土大黄检查及大黄素和大黄酚含量测定。而关于三黄片中辅料聚丙烯酸树脂 II的质量研究,现行质量标准没有对其做出明确规定,文献资料中也尚未报道。为了探讨这一问题,本文以聚丙烯酸树脂#(原料)的质量标准为基础,以模拟包衣随行辅料样品、未包衣样品为对照,考察其在制剂中的性状、鉴别和含量测定等,建立相应的测定方法,以期更好地控制三黄片的质量。1?仪器与试剂Spectrumone b型红外分光光度计(英国珀金埃默尔仪器公司);Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国)。甲醇(色谱纯,Fisher),水为重蒸水,其它试剂均为分析纯。聚丙烯酸树脂 II(EudragitL100):湖州展望药业有限公司生产,批 号:070301。聚丙烯酸 树脂 II包衣的三黄片(070301,070302,070303)及未包衣的三黄片(070301):成都中医药大学中药制剂教研室制备。2?方法与结果2.1?性状 将薄膜包衣从制剂上剥离,观察其性状特征,对比模拟包衣样品。模拟包衣样品的制备:取聚丙烯酸树脂 II适量,精密称重,模拟制剂过程,以 70%乙醇溶解,搅拌后静置过夜,加入 1%的甘油,于玻璃板上挥干。表 1?原料、模拟包衣样品、三黄片性状样品性状聚丙烯酸树脂 II(原料)白色粉末,无臭无味,不溶于水,乙醇中结块,在温乙醇中缓慢溶解模拟包衣样品透明薄膜,无臭无味三黄片透明薄膜,无臭无味2.2?鉴别 采用红外光谱法进行鉴别。2.2.1?供试品的制备 分别取聚丙烯酸树脂 II(原料)及其包衣后的三黄片和模拟包衣样品 5mg,加入 500mg干燥 KBr晶体,混匀,研磨后压片,于 4 000 450 c m-1红外区扫描。2.2.2?对照品制备 以标准 Eudragit L100为对照。2.2.3?包衣前后红外光谱对比 红外光谱图见图 1 4。结果表明,三黄片中聚丙烯酸树脂 II的 IR谱与聚丙烯酸树脂 II原料及其模拟包衣样品的特征峰 IR谱的峰位、峰宽、峰高均相似,表明辅料聚丙烯酸树脂 II在三黄片中性质依然稳定。2.3?含量测定 中国药典%2005年版#部中丙烯酸树脂类辅料尚无含量测定项,参考国外药典 2,采用滴定法测定三黄片制剂中聚丙烯酸树脂#中丙烯酸单元的含量。方法:取样品约 0.1 g,精密称重,以丙酮 异丙醇(3 2)10m l溶解,滴加几滴酚酞指示剂,用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定,计算所含甲基丙烯酸单元的含量,每毫升 0.1mol/L NaOH 溶液相当于 8.609mg甲基丙烯酸单元。图 1?原料红外光谱图?图 2?三黄片中聚丙烯酸树脂 II红外光谱图图 3?模拟包衣样品红外光谱图?图 4?对照品红外光谱图2.3.1?方法学考察 3148 时珍国医国药 2009年第 20卷第 12期LISHIZHEN MEDICI NE AND MATERI A MED I CA RESEARCH 2009VOL.20 NO.12