第四讲营养缺陷型菌株筛选.ppt

诱变育种诱变育种诱变剂诱变剂诱变育种步骤诱变育种步骤物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂出发菌株的选择出发菌株的选择单孢子悬液的制备单孢子悬液的制备菌丝尖端法菌丝尖端法处理菌落周围的尖端菌丝处理菌落周围的尖端菌丝混合培养法混合培养法原生质体是异质的原生质体是异质的不具有细胞壁不具有细胞壁不产孢子的菌株诱变时会有遗传不产孢子的菌株诱变时会有遗传分离或遗传不稳现象分离或遗传不稳现象诱变处理诱变处理诱变剂种类选择诱变剂种类选择最适诱变剂剂量的选择最适诱变剂剂量的选择诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式影响突变率的因素影响突变率的因素1、菌种的遗传特性不同、菌种的遗传特性不同2、菌体的细胞壁结构不同、菌体的细胞壁结构不同3、环境条件的影响、环境条件的影响 诱变前预培养和诱变后培养诱变前预培养和诱变后培养 温度、温度、pH、氧气等外界条件、氧气等外界条件 对诱变效应的影响对诱变效应的影响 平皿密度效应平皿密度效应第一页，共十五页。第三节营养缺陷第三节营养缺陷(quxin)(quxin)(quxin)(quxin)型菌株的型菌株的筛选筛选 营养缺陷(quxin)(quxin)型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。营营养养(yngyng)缺缺陷陷型型的的用用途途第二页，共十五页。一、基本概念一、基本概念二、筛选二、筛选(shixun)营养缺陷型的步骤营养缺陷型的步骤（一）诱变(yu bin)（二）淘汰野生型（三）检出缺陷型（四）确定生长谱第三页，共十五页。1 1、野生型菌株（、野生型菌株（wild type strainwild type strain）2 2、营养缺陷型（、营养缺陷型（auxotrophauxotroph）：）：指通过诱变而产生的缺缺乏乏合合成成某某些些营营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中中加加入入(jir)(jir)相相应应的的营营养养成成分分才才能能正正常常生生长长的的变变异株。异株。3 3、原养型（、原养型（prototrophprototroph）：）：营养缺陷型菌株经回回复复突突变变或或重重组组变变异异后后产产生生的菌株，其营养要求在表型上相同。的菌株，其营养要求在表型上相同。一、基本概念：一、基本概念：第四页，共十五页。与之有关的培养基有三类1 1、基本培养基、基本培养基(MM)(MM)：minimal mediumminimal medium 能满足野生型菌株正常生长的培养基；-2、完全培养基(CM)：complete medium 能满足各种(zhzhn n)营养缺陷型营养要求的天然或半合成培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基；+3 3、补充培养基、补充培养基SM)(SM)：supplemental mediumsupplemental medium 在基本培养基中加入相应的营养成分；AB第五页，共十五页。二、筛选营养二、筛选营养(yngyng)(yngyng)(yngyng)(yngyng)缺陷型的步骤缺陷型的步骤uu诱变(yu bin)(yu bin)uu淘汰野生型uu检出缺陷型uu确定生长谱第六页，共十五页。（一）诱变（一）诱变(yu bin)(yu bin)(yu bin)(yu bin)方法方法用于诱发营养(yngy(yngyng)ng)缺陷型的诱变剂有：uu亚硝基胍uu紫外线uu亚硝酸第七页，共十五页。1、抗生素法：、抗生素法：原理：原理：一般细菌可以采用青霉素，酵母一般细菌可以采用青霉素，酵母(jiom(jiom)可采用制霉菌素。可采用制霉菌素。2 2、菌菌菌菌丝丝丝丝过过过过滤滤滤滤法法法法：对对于于霉霉菌菌，因因孢孢子子生生长长后后会会长长出出菌菌丝丝体体，就就可可用用滤滤纸纸过过滤滤法法将将菌菌丝丝滤滤去去，而而缺缺陷陷型型孢子却因未发芽而不能滤过。孢子却因未发芽而不能滤过。3 3、高高高高温温温温杀杀杀杀菌菌菌菌法法法法：利利用用芽芽孢孢菌菌类类的的芽芽孢孢和和营营养养体体对对热热敏敏感性的差异。感性的差异。（二）淘汰（二）淘汰(toti)(toti)(toti)(toti)野生型野生型MMCMCMMMMMCM加青霉素第八页，共十五页。（三）缺陷三）缺陷(quxin)(quxin)(quxin)(quxin)型的捡出型的捡出uu原原理理：缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。uu具体方法：具体方法：影印(y(yngyn)ngyn)法、点种法 夹层法、限量补充法无营养无营养(yngyng)缺缺陷陷MM MM+FCM其他营养其他营养缺陷缺陷F营养缺陷营养缺陷第九页，共十五页。（1 1）将将一一较较平平皿皿直直径径小小1cm1cm的的金金属属圆圆筒筒蒙蒙上上一一层层灭灭菌菌(mi(mi jn)jn)的丝绒，用金属夹夹住，灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌(mi jn)(mi jn)。（2 2）完完全全培培养养基基上上长长出出的的全全部部菌菌落落在在丝丝绒绒上上轻轻轻轻一一压压，使之成为印模，标记方位。使之成为印模，标记方位。（3）将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位同一方位同一方位同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。、影印、影印(yngyn)(yngyn)(yngyn)(yngyn)法法第十页，共十五页。（4）将CM和MM在恒温箱中培养。（5 5）二二平平皿皿相相同同方方位位进进行行比比较较，即即可可发发现现在在MMMM平平皿皿上上长长出出的的菌菌落落少少于于CMCM平平板板上上的的。MMMM上上未未长长而而相相应应于于CMCM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有(yn yu)(yn yu)一定间隔。MMCM第十一页，共十五页。、点种、点种(din zhng)(din zhng)(din zhng)(din zhng)法法uu 用用接接种种针针或或牙牙签签将将CMCM上上长长出出的的菌菌落落(jnlu)(jnlu)在在MMMM和和CMCM两两副副平平板板上上接接种种，依依次次在在相相应应位位置置点点种种，然然后后一一起起培培养养，观察其生长情况。观察其生长情况。uu 此法结果明确，但工作量大。此法结果明确，但工作量大。CMCMMM第十二页，共十五页。、夹层、夹层(jicng)(jicng)(jicng)(jicng)法法 先先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MMMM，凝凝固固后后再再倒倒一一薄薄层层MMMM琼琼脂脂培培养养基基，培培养养24h24h，将将出出现现的的菌菌落落标标记记，然然后后倒倒上上一一层层CMCM琼琼脂脂培培养养基基，再再培培养养。这这时时第第二二批批长长出出的的菌菌落就可能是缺陷型。落就可能是缺陷型。此此法法缺缺点点是是，结结果果有有时时不不明明确确(mngqu)(mngqu)，而而且且将将缺缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。基本琼脂培养基含菌的MMCM第十三页，共十五页。该法有两种情况：（1）目的是捡出营养缺陷型方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长(shngzh(shngzhng)ng)缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。（2）目的是定向筛选某种特定的缺陷型在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质。、限量、限量(xinling)(xinling)补充法补充法第十四页，共十五页。内容(nirng)总结诱变育种。温度、pH、氧气等外界条件。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。1、野生型菌株（wild type strain）。指通过诱变而产生的缺乏合成某些(mu xi)营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上相同。AB。具体方法：影印法、点种法。夹层法、限量补充法第十五页，共十五页。