第六章食品的卫生细菌学检验.ppt

食品质量检测(jinc)技术第一页，共五十八页。第一节食品第一节食品(shpn)中菌落总数的测定中菌落总数的测定第二页，共五十八页。一、一、菌落菌落(jnlu)(jnlu)总数总数 是指食品是指食品检样经过处理，在一定理，在一定(ydng)(ydng)条条件下培养后件下培养后,所得所得1mL(g)1mL(g)或或1cm1cm2 2面积检样面积检样中所含菌落的总数。中所含菌落的总数。第三页，共五十八页。二、菌落总数二、菌落总数(zngsh)测定的意义测定的意义1 1、判定食品被、判定食品被细菌菌污染的程度染的程度(chngd)(chngd)及及卫生生质量量。2 2、预测食品存用的期限食品存用的期限长短。短。3 3、了解、了解细菌在食品中的繁殖菌在食品中的繁殖动态。第四页，共五十八页。三、菌落总数三、菌落总数(zngsh)测定的方法测定的方法 平板平板(pngbn)倾注法倾注法 平板表面涂布法平板表面涂布法 平板表面点滴法平板表面点滴法第五页，共五十八页。四、平板四、平板(pngbn)倾注法测定菌落总倾注法测定菌落总数数检验步骤检验步骤(bzhu)(程序程序)：检样检样稀释处理稀释处理做平板做平板培养培养菌落计数菌落计数报告结果报告结果第六页，共五十八页。（一）、样品稀释（一）、样品稀释(xsh)及做平及做平板板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入加入46营养营养(yngyng)琼脂琼脂1215ml25g/ml样品(yngpn)生理盐水第七页，共五十八页。检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间用时间(shjin)不宜超过不宜超过20min，以防止细菌，以防止细菌有所死亡或繁殖。有所死亡或繁殖。第八页，共五十八页。（二）培养（二）培养(piyng)普通食品普通食品:37 48h 倒放平板倒放平板(pngbn)清凉饮料、调味品、糕点、酒类：清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37 24h 水产品水产品:30 48h 第九页，共五十八页。（三）计数（三）计数(j sh)(j sh)和报告和报告 到达到达规定培养定培养(piyng)(piyng)时间，应立即立即计数。如果不能立即计数，应将平板数。如果不能立即计数，应将平板放置于放置于0 044，但不得超过，但不得超过24h24h。第十页，共五十八页。1、菌落(jnlu)的选择（1 1）、单个菌做一个菌落）、单个菌做一个菌落(jnlu)(jnlu)计计 （2 2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。一个菌落计算。（3 3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘匀，则可以半个平板的菌落数乘2 2代表全平板的菌落代表全平板的菌落数。数。第十一页，共五十八页。2、平板菌落计数(j sh)的选择 （1 1）、）、选取菌落数在取菌落数在30300之间的平板（之间的平板（SN标准要求为标准要求为25250个菌落）个菌落），若有二个稀释度若有二个稀释度均在均在30300之间时，比值小于或等于之间时，比值小于或等于(dngy)(dngy)2取取平均数，比值大于平均数，比值大于2则其较小数字。则其较小数字。第十二页，共五十八页。（2）、如均大于）、如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告数乘以稀释倍数报告(bogo)（3）、如均小于）、如均小于30，则以最低稀释度的平均菌，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告落数乘稀释倍数报告（4）、如菌落数有的大于）、如菌落数有的大于300，有的又小于，有的又小于30，不在不在30300之间，以最接近之间，以最接近300或或30的平均菌的平均菌落数乘以稀释倍数报告落数乘以稀释倍数报告（5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于于1乘以最低稀释倍数报告。乘以最低稀释倍数报告。第十三页，共五十八页。3、菌落(jnlu)数的报告菌落数在菌落数在1100时，按实有数字时，按实有数字(shz)(shz)报告，报告，1)1)如大于如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。数按四舍五入计算。2)2)固体检样以克（固体检样以克（g)为单位报告，为单位报告，3)3)液体检样以毫升（液体检样以毫升（ml）为单位报告，）为单位报告，4)4)表面涂擦则以平方厘米（表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。）报告。第十四页，共五十八页。(四四)、检验、检验(jinyn)注意事项注意事项1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；管口的外围部分；3、吸管插入试样、吸管插入试样(sh yn)液内的深度不得小于液内的深度不得小于2.5cm,调调整时要使管尖与容器内壁紧贴整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触吸管口不得与稀释液接触;第十五页，共五十八页。5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过时间不宜超过20min.6、稀释倍数、稀释倍数(bish)愈高菌落数愈少，稀释倍愈高菌落数愈少，稀释倍数数(bish)愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。不可作为检样计数报告的依据。第十六页，共五十八页。复习题1、什么是菌落总数菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数菌落总数的检验中，如何根据(gnj)样品的特性选择培养温度和时间？第十七页，共五十八页。第二节第二节 食品食品(shpn)中大肠菌群的检中大肠菌群的检验验第十八页，共五十八页。一、大肠菌群一、大肠菌群 1、什么是大肠菌群？什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性的革兰氏染色阴性(ynxng)(ynxng)无芽胞杆菌。无芽胞杆菌。2 2、大、大肠菌群的菌群的组成成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。属和阴沟肠杆菌。第十九页，共五十八页。属代表种致病性埃希氏菌属（Escherichia）大肠埃希氏菌(E.coli)肠道外感染，急性腹泻 志贺氏菌属（Shigella）痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)细菌性痢疾爱德华氏菌属（Edwardsiella）迟纯爱德华氏菌(E.tarda)蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属（Salmonella）伤寒沙门氏菌(S.typhi)肠热症、急性肠炎、败血症枸橼酸杆菌属(Citrobacter)弗劳地氏枸橼酸杆菌(C.freundii)条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等 阴沟肠杆菌(Enterobacter)产气杆菌(E.aerogenes)很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属(Hafnia)蜂窝啥夫尼亚菌(H.alvei)对人无致病性沙雷氏菌属(Serrati)粘质沙雷氏菌(S.marcescens)条件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及创伤感染 变形杆菌属(Proteus)普通变形杆菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等耶尔森氏菌属(Yersinia)鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)鼠疫欧文氏菌属(Erwinia)草原居民欧文氏菌(E.herbicola)植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到第二十页，共五十八页。1 1、粪便便污染染(wrn)(wrn)的指的指标菌：菌：大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌二、二、大肠菌群的测定大肠菌群的测定(cdng)(cdng)意义意义第二十一页，共五十八页。2、以大肠菌群作为粪便指标、以大肠菌群作为粪便指标(zhbio)菌原因菌原因1)在粪便中数量最大；在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同在外环境中存活的时间与致病菌大体相同(xin tn)；3)检测方法简便容易。检测方法简便容易。第二十二页，共五十八页。3、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义（1）、判断食品中是否受到粪便污染。）、判断食品中是否受到粪便污染。（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）、有利于控制食品在生产）、有利于控制食品在生产(shngchn)加工、加工、运输、保存等过程中的卫生状况。运输、保存等过程中的卫生状况。第二十三页，共五十八页。三、三、大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性(txng)(txng)1.1.形形态与染色：革与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落培养特性：在琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起心深紫色，圆形，稍凸起(t q)，边缘整齐，表面光滑，常，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。第二十四页，共五十八页。EMB平板平板(pngbn)照片及原理照片及原理第二十五页，共五十八页。麦康凯琼脂麦康凯琼脂(qingzh)(qingzh)平板平板 Ageofcultureis24h第二十六页，共五十八页。大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基-COLI ID 用于在37下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的鉴定本培养基含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌群（coliforms）和鉴定大肠杆菌（Escherichiacoli）,而不需附加任何试剂。菌落颜色玫瑰红蓝色透明.-葡萄糖苷酶+-.-半乳糖苷酶+-.大肠杆菌其它大肠菌群其它革兰氏阴性菌.-半乳糖苷酶（+）大肠菌群存在-半乳糖苷酶（+）大肠菌群存在-葡萄糖苷酶（+）大肠杆菌存在-葡萄糖苷酶（-）无大肠菌群存在第二十七页，共五十八页。大肠杆菌平板菌落大肠杆菌平板菌落(jnlu)照片照片肠杆菌肠杆菌(gnjn)扫描电镜照片扫描电镜照片.第二十八页，共五十八页。四、四、大肠菌群大肠菌群检验检验(jinyn)(jinyn)方法及操作方法方法及操作方法国家标准：国家标准：三步法：乳糖胆盐发酵试验三步法：乳糖胆盐发酵试验(shyn)(shyn)分离培养分离培养证实试验证实试验(shyn)(shyn)(乳糖发酵试验乳糖发酵试验(shyn)(shyn)行业标准：行业标准：两步法：推测试验两步法：推测试验证实试验证实试验 第二十九页，共五十八页。检样稀释(xsh)处理EMB等革兰氏染色(rns)乳糖(rtn)发酵管革兰氏阴性无芽胞产气革兰氏阳性大肠杆菌阴性大肠杆菌阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管产气不产气大肠杆菌阴性报告报告报告大肠杆菌阳性第三十页，共五十八页。1:1001:10各加入(jir)1ml各加入(jir)10ml各加入(jir)1ml单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/mlEMB分离培养证实试验乳糖发酵管镜检查MPN表报告结果第三十一页，共五十八页。表表1 1 粪大肠菌群在几种常用分离粪大肠菌群在几种常用分离(fnl)培养基上的菌落特征培养基上的菌落特征培养基 菌落特征 伊红兰培养基(EMB)紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色 品红亚硫酸纳(远藤氏平板)紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金属光泽，淡红色、中心较深 中国兰平板深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色麦康凯平板(Mac C)桃红色，粉红色、中心桃红色第三十二页，共五十八页。MPN法简介法简介(jin ji)The Most Probable Number Method第三十三页，共五十八页。1g/ml检样中最近似值检样中最近似值(MPN)表表以1、0.1、0.01、各用3管。阳性管数MPN 个个/100 g/ml1g/ml30.1g/ml30.01g/ml300030001300026000390010300116001290013120020600219002212002315003090031130032160033190第三十四页，共五十八页。五、粪大肠菌群的检验五、粪大肠菌群的检验(jinyn)粪大肠菌群粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在系一群需氧及兼性厌氧，在44.5培养培养24h内能发酵乳糖内能发酵乳糖(r tn)产酸产气和产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。菌。第三十五页，共五十八页。检验检验(jinyn)方法方法检样检样产酸产气查查MPN表表报告报告(bogo)EMB 分离分离(fnl)靛质基试靛质基试验验阳性反应方法一：方法一：45 EC肉汤发酵肉汤发酵 稀释稀释44乳糖乳糖胆盐发酵胆盐发酵方法二：方法二：检样检样稀释稀释36乳糖乳糖胆盐发酵胆盐发酵产酸产气产酸产气EMB 分离分离查查MPN表表报告报告第三十六页，共五十八页。1、从制备、从制备(zhbi)样品匀液至稀释完毕样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过全过程不得超过15min。2 2、对产酸但未看到气泡的乳糖酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手酵，用手轻打打动试管，如有管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。步试验。3 3、挑、挑选菌落菌落进行行证实试验时，最少要挑，最少要挑2 2个以上的个以上的典型典型菌落或非典型菌落进行接种。菌落或非典型菌落进行接种。4 4、不可用其他胆、不可用其他胆盐代替指定的胆代替指定的胆盐。六、检验六、检验(jinyn)注意事项注意事项第三十七页，共五十八页。EMB平板照片平板照片(zhopin)及原理及原理第三十八页，共五十八页。靛基质试验原理靛基质试验原理(yunl)及照及照片片第三十九页，共五十八页。七、七、大肠菌群快速大肠菌群快速(kui s)检验检验食品大肠菌群快速检验大肠菌群快速检验(jinyn)方法：方法：TTC显色法；显色法；DC试管法；试管法；纸片法。纸片法。第四十页，共五十八页。（一）食品饮料大肠菌群快速（一）食品饮料大肠菌群快速(kui s)检验纸检验纸片片使用方法：1.1.样品稀品稀释同国同国标法法 2.2.接种：接种：饮料和料和饮用水采用用水采用(ciyng)(ciyng)原液、原液、1:101:10、1:100 1:100三个三个稀稀释度，固体食品采用释度，固体食品采用1:1 1:1、1:101:10和和1:1001:100三个稀释三个稀释度。用度。用1 1亳升灭菌吸管吸取亳升灭菌吸管吸取1 1亳升同一稀释度的稀释液亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。第四十一页，共五十八页。3.培养：培养：将接种将接种(jizhng)好的纸片轻轻压平（可叠放），好的纸片轻轻压平（可叠放），在在36下培养下培养1524h观察结果。观察结果。4.结果判定结果判定:纸片上出现紫红色斑点纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者其周围有黄圈者,为阳性为阳性.纸片为一种着色纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性无菌落生长者为阴性.纸片呈紫兰色纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性阴性.酸性食品接种后酸性食品接种后,纸片变黄纸片变黄,经培养后无紫红色经培养后无紫红色斑点为阴性斑点为阴性第四十二页，共五十八页。（二）餐具大肠菌群快速（二）餐具大肠菌群快速(kui s)检验检验(纸片法纸片法)使使 用用 方方 法法：1.1.采样采样610610份。份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面片后，立即贴于食具内侧表面(biomin)(biomin)，3030秒后取下，置秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以于原塑料袋内。筷子以5 5只为一份样品，用吸管吸取生理只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm5cm）抹拭两张，）抹拭两张，放入原塑料袋内放入原塑料袋内。第四十三页，共五十八页。2.将已采样的纸样置于将已采样的纸样置于37C培养培养15小时小时.纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性为大肠菌群阴性(ynxng)。同一份样品两张纸片均。同一份样品两张纸片均是阴性是阴性(ynxng)为合格。为合格。第四十四页，共五十八页。食品冷饮(lngyn)大肠菌群检验纸片冷饮(lngyn)、乳制品和调味品等大肠菌群的测定第四十五页，共五十八页。食品食品饮料大料大肠菌群快速菌群快速检验纸片片饮料、食用料、食用(shyng)纯水和糕点的大水和糕点的大肠菌群菌群测定定第四十六页，共五十八页。餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果(xiogu)检测第四十七页，共五十八页。大肠菌群测试片适用于需要对大肠菌群准确计数的样品，如消毒(xio d)牛乳、冷饮和调味品等。第四十八页，共五十八页。八、水的大肠菌群检验八、水的大肠菌群检验(jinyn)大肠菌群大肠菌群MPN/100mL 细菌总数细菌总数 CFU/mL 生活饮用水生活饮用水 3/L100 瓶装饮用纯净水瓶装饮用纯净水 3 20 饮用天然矿泉水罐装产品饮用天然矿泉水罐装产品 050地面水质量标准地面水质量标准 10000个个/L 准备加氯消毒后供饮用的水准备加氯消毒后供饮用的水 1000准备加氯消毒后供饮用的水准备加氯消毒后供饮用的水 10000游泳池水游泳池水 1001000第四十九页，共五十八页。（一）、水样的采集（一）、水样的采集(cij)(cij)1 1、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流5 51010后取后取样。2 2、地地面面水水源源水水：江江湖湖河河，水水库，水水池池等等。浸浸入入水水下下20cm20cm下下取取样。水水井井50cm50cm下取下取样。3 3、漂漂白白粉粉处理理(chl)(chl)的的水水样：自自来来水水，游游泳泳池池水水，应在在瓶瓶内内加加入入0.03g0.03g硫代硫酸硫代硫酸钠/500ml/500ml，或，或2ml 1.5%2ml 1.5%硫代硫酸硫代硫酸钠液液/500ml/500ml，除，除氯。4 4、运送：、运送：2 2小时内送到检验室。小时内送到检验室。6 61010，6h,6h,立即立即检验.5 5、检验前：将水样振摇、检验前：将水样振摇5 51010分分钟。第五十页，共五十八页。（二）、生活饮用水或食品生产（二）、生活饮用水或食品生产(shngchn)(shngchn)用水的检验（用水的检验（大大肠肠菌群菌群 ）各加10ml各加100ml水样初发酵(fjio)三料乳糖(rtn)胆盐50毫升装三料乳糖胆盐5毫升装EMB分离36培养24h复发酵乳糖发酵镜检36培养24h第五十一页，共五十八页。大大肠肠菌群菌群检索检索(jin su)(jin su)表（饮用水）表（饮用水）100ml阳性管数 10ml阳性管数012每L水中大大肠肠菌群菌群数数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230第五十二页，共五十八页。（三）、瓶装矿泉水的检验(jinyn)（大大肠肠菌群菌群 ）原水样双料乳糖胆盐发酵(fjio)管10毫升装37培养(piyng)24h产酸产气者亮绿乳糖胆盐发酵管37培养48h产酸产气者查表报告各加入10ml水样第五十三页，共五十八页。矿泉水的检验(jinyn)检索表阳性管数MPN/100mL0012.225.139.24165 16第五十四页，共五十八页。(四四)、水源、水源(shuyun)水的检验水的检验 接种量接种量 严重严重(ynzhng)污染水：污染水：1、0.1、0.01、0.001ml各各1份份 总量：总量：1.111ml 中度污染水：中度污染水：10、1、0.1、0.01ml各各1份份 总量：总量：11.11ml 轻度污染水：轻度污染水：100、10、1、0.1ml各各1份份 总量：总量：111.1ml第五十五页，共五十八页。原水样接种量接种量100ml用三用三料乳糖料乳糖(r tn)胆盐胆盐 接种量接种量10ml用双料用双料乳糖胆盐乳糖胆盐 接种量接种量1ml用单用单料乳糖胆盐料乳糖胆盐EMB分离(fnl)乳糖(rtn)发酵复发酵36培养24h36培养24h查表报告查表报告镜检第五十六页，共五十八页。复习题1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项(shxing)？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？第五十七页，共五十八页。内容(nirng)总结第六章 食品的卫生细菌学检验。是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数。（2）、如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（3）、如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告。（5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。1.形态与染色：革兰氏染色阴性(ynxng)，无芽胞杆菌。桃红色，粉红色、中心桃红色第五十八页，共五十八页。