生化分析讲课教程（共6章115页）.doc

第一章：常用生物化学实验技术及原理

第一节 生物大分子的基本制备技术

生物大分子的制备过程包括选材、细胞的破碎和细胞器的分离、生物大分子的提取和分离、样品的纯化、以及样品的浓缩干燥和储存等方面。生物大分子的制备工作是一件十分细致的工作，既要设法得到它们的纯品，又要努力保持其生物活性。有时制备一个较高纯度的蛋白质、酶或核酸，需要付出较长时间的艰苦劳动。生物大分子制备方法的选择是以生物大分子的性质（如分子大小、形状、溶解度、带电性质等）为依据的（表1-1）。对于结构和理化性质不同的生物大分子，所选用的分离提纯方法也不相同。

表1-1 生物大分子的理化性质与分离纯化方法的比较
理化性质
相应的分离、纯化方法
分子大小和形态
溶解度
电荷差异
生物功能专一性
差速离心、超滤、分子筛、透析
盐析、萃取、分配层析、结晶
电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析
亲和层析
在制备生物大分子的过程中，为了随时了解所用方法的优劣、选择条件的效果如何、追踪提纯物质含有何种组分、以及纯度和得率如何，必须对所提纯的生物大分子随时进行分析鉴定。因此在提纯以前，必须首先建立对生物大分子的相应分析鉴定方法。在分离、纯化过程中每一步都对生物大分子的比活性（总活性除以总蛋白量的值）、得率（每一步骤所得总活性与第一步所得总活性的百分比，设开始时的总活性为100%）和提纯倍数（每一步骤所得比活性与第一步所得的比活性的比值，设开始时为1）进行测定。现以猪肝异檬酸脱氢酶提纯过程为例，将提纯过程的各步追踪数字列于表1-2。
下面仅将生物大分子的分离、纯化过程的一些基本技术做一介绍：
一、盐析（Salting-out）技术
盐析方法是蛋白质和酶提纯工作中应用最早，至今仍广泛应用的方法。其原理是蛋白质在高浓度盐的溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。

表1-2 猪肝异柠檬酸脱氢酶的提纯

步骤
总体积（ml）
酶浓度
（单位/ml）
酶总活性
（单位）
蛋白质浓度
（mg/ml）
总蛋白质量
(mg)
比活性
（单位/mg）
得率（%）
提纯倍数
匀浆
7.00
2.85
19.95
35.50
248.50
0.080
100
1.0
氯仿抽提
5.00
3.60
20.88
19.20
111.40
0.187
105
2.3
37。5-55%硫酸铵盐析的上清液（透析）
1.50
11.25
16.87
21.40
32.10
0.525
845
6.5
DEAE纤维素
2.39
3.32
9.09
1.00
2.38
3.82
455
477
磷酸钙层析
0.45
15.05
6.77
0.90
0.41
16.70
34
209
凝胶过滤
0.52
9.80
5.09
0.22
0.11
45.60
255
570
从表1-2可知猪肝异柠檬酸脱酶被提纯570倍。得率是25.5%。
在盐析时，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度（见第四章电泳）关系可用下式表示：

式中S0是蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度，S为蛋白质在离子强度为I的溶液中的溶解度，KS为盐析常数。
上述公式中当温度和pH一定时，S0仅取决于蛋白质的性质。因此对于同一蛋白质，在一定温度和pH时，S0是一常数。
设 Log S0 =β
则 Log S=β－KS×I
盐析常数KS主要取决于盐的性质（盐的离子价数和离子平均半径）,也和蛋白质的性质有关。不同的蛋白质在同一种盐溶液中的KS值不同，KS值愈大，盐析效果愈好。从上述公式可知在温度和pH一定的同一种盐溶液中，不同蛋白质有各自一定的β和KS值。可以通过改变盐的离子强度来分离不同的蛋白质。这种方法称分段盐析法。对于同一种盐溶液，如果保持离子强度不变，通过改变温度和pH来改变β值，也可达到盐析分离的目的。这种方法称为“β分段盐析法”。
盐析法提纯蛋白质时应考虑以下几个条件的选择。
（一）盐的种类
蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。应用最广泛的是硫酸铵，硫酸铵的优点是：
1．溶解度大。25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大约每升水可溶解767克之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以被盐析沉淀出来。
2．温度系数小，硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如0℃时，硫酸铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g 。对于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。
3．硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格低廉，容易获得。
硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（二） 盐的浓度
分段盐析法是通过改变盐的浓度达到分离目的，应该将盐的浓度准确地分步提高到各种蛋白质所需的浓度。盐的浓度常用饱和度表示，饱和溶液定为100%。调整硫酸铵溶液饱和度的方法有计算、查表两种：
1．添加饱和溶液的计算法
如S2为所需达到的饱和度，S1为原来的饱和度。V为达到所需饱和度的溶液体积，Vo为原来的体积。则

体积的改变造成的误差小于2%，可以忽略不计。
2．查表法（表1-3）
可以从表中直接查到将1升饱和度为S1的浓度提高到饱和度为S2的浓度时所需添加固体硫酸铵的重量(克)。
表1-3 室温下由S1 提高到S2 时每升加固体硫酸铵的克数

（三）pH值
如前所述，β值与溶液的pH值有密切关系。当溶液的pH值达到蛋白质等电点时，β值最小，蛋白质的溶解度最低，最易从溶液中析出，因此在盐析时，应控制溶液的pH值使之接近蛋白质的等电点。
（四）温度
温度对β值的影响不如对pH值的影响显著。因此，对温度的要求不严格，低温主要是防止蛋白质变性和水解。
（五）蛋白质浓度
溶液中蛋白质浓度愈高，盐析所需的盐饱和度愈低。所以，盐析的蛋白质浓度不宜过低。但过高的蛋白质浓度也不适合，因会和其它蛋白产生共沉淀作用，影响纯度。
二、透析和超滤 (Dialysis and Ultrafiltration)
1．透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜而进行纯化的一种方法。方法是将含盐的生物大分子溶液装入透析袋内。并将袋口扎好放入装有蒸馏水的大容器中，用搅拌方法使蒸馏水不断流动经过一段时间后，透析袋内除大分子外，小分子盐类透过半透膜进入蒸馏水中（图1—1），使膜内外盐浓度达到平衡。如在透析过程中更换几次大容器中的液体，可以使透析袋内的溶液达到脱盐的目的。脱盐透析是应用最广泛的一种透析方法。平衡透析也是常用的透析方法之一。方法是将装有生物大分子的透析袋装入盛有一定浓度的盐溶液或缓冲液的大容器中，经过透析，袋内外的盐浓度（或缓冲液pH）一致，从而有控制地改变被透析溶液的盐浓度（或pH）。
如将透析袋放入高浓度吸水性强的多聚物溶液中，透析袋内溶液中的水便迅速被袋外多聚物所吸收，从而达到袋内液体浓缩的目的。这种方法称为“反透析”。可用做反透析的多聚物有聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone, PVP）、右旋糖、蔗糖等。透析用的半透膜很多，玻璃纸、棉胶、动物膜、皮纸等都可用来制作半透膜。

2．超滤法是利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法（图1-2）。
三、减压浓缩冷冻干燥
因为生物大分子通常遇热不稳定，极易变性，浓缩和干燥生物大分子不能用加热蒸发的方法。因此减压浓缩和冷冻干燥已成为生物大分子制备过程常用的浓缩干燥技术。低压冻干法是使蛋白质溶液在圆底烧瓶的瓶壁上冷冻，同时在真空中让液体升华，以得到冻干的样品。通过冷冻干燥所得的产品能够保持生物大分子物质的天然性质，还具有疏松，易于溶解的特性，便于保存和应用。这是保存生物大分子最常用和最好的方法。

第二节 分光光度法

一、基本原理
光线是高速运动的光子流，也是具有波长和频率特征的电磁波。光子的能量与频率成正比，与波长成反比。肉眼可见的光线称为可见光。可见光只占电磁波谱的很窄部分(400nm到760nm)。不同波长的可见光具有不同的颜色。波长大于760nm的光线称为红外线。波长小于400nm的光线称为紫外线。
当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。例如核黄素之所以呈现黄色，是由于它仅吸收可见光中的蓝光范围，并测得其吸收峰在450nm（图1-3）。在紫外光范围它还有两个吸收峰。它们分别是260nm和370nm。
分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。

（核黄素22mmol/L溶于
0.1mol/L 磷酸钠中，
pH7.06，吸收杯厚1cm）

图1-3 核黄素200～500波长的吸收光谱

（一）郎伯定律(Lambert’s Laws)
一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著(图1-4)

图1-4光吸收与溶液厚度的关系

若I0表示入射光强度，I表示光线通过溶液后的强度，L表示溶液的厚度。

则
－d I

＝αI, 　　－
d I

＝αI, 或
d I

＝αd L
d L
d L
I

积分：∫
d I

＝－∫αd L
I
得：InI=－αL＋C
当Ｉ=0时，I=I0，所以C=InI0
即 InI=－αL＋InI0

所以 In
I0

＝αL 或
I

＝e-αL
I
I0

或 Log
I0

＝K1L (K=
α

),
I

＝10-K1L
I
2.303
I0
K1是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液浓度影响。从上述公式可知，透过溶液后，光强度的减弱（I/I0）与溶液厚度（L）呈指数函数关系。可见光强度的改变与溶液厚度并不呈简单的正比关系。这一关系就是郎伯定律。
（二）比尔定律(Beer’s Law)
当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度减弱也愈显著，与上定律相似。两者的关系可以表示如下：

Log
I0

＝K2C, 或
I

=10-K2C
I
I0
其中，C表示溶液的浓度。K2是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液厚度的影响。上述公式所表示的光强度与溶液浓度的关系称为比尔定律。
虽然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比尔定律。这是由于有些物质在不同浓度条件下其颜色可能发生改变，即在不同浓度条件下其吸收光的波长发生改变。常见的原因如下：
1．有些有色物质在溶液中可能解离成相应的离子，离子的颜色与分子的颜色不同，造成对比尔定律的误差。
2．有些物质在较高浓度状态下可形成络合物，络合物使吸收光谱发生改变。例如：氯化钴在稀溶液中呈玫瑰色，而在浓溶液中呈蓝色。
CoCl2 + CoCl2→Co2+ (CoCl4)2-
玫瑰色 蓝色
3．氢离子浓度和电解质也可引起一些有色物质颜色的改变，这些改变也可能造成比尔定律的误差。
（三）郎伯——比尔定律及其应用

Log
I

＝-KCL 或
I

=10-KCL
Io
Io
一般将通过溶液后的光线强度（I）和入射光（Io）的比值称为透光度(transmittance, T)，将-Log 用光密度(Optical density, O.D.或D)表示，以反映该溶液对光吸收的情况。有时也用吸光度(absorbance, A)表示。则它们之间的关系如下

A（D）=－Log
I

＝－LogＴ ＝ＥＣＬ ……(1)
Io
其中，Ｅ为消光系数(Extinction coefficient), 表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。
从公式（1）可知对于相同物质和相同波长的单色光（消光系数不变）来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。

D1

＝
C1

或写作 C1=
D1

×C2 (2)
D2
C2
D2
如果C2为标准溶液的浓度，则可根据测得的光密度值，按公式（2）求得待测溶液的浓度。
实际工作中为简便起见，常常不是每测一个待测样品都做一个标准管，而是事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以光密度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质的光密度后，便可从标准曲线上查到相应的浓度数值。
从公式（1）可知，若知道某待测物质的消光系数和溶液的厚度，也可以从光密度推算出待测溶液的浓度。消光系数的常用表示方法有二：
1．百分消光系数（E1%1cm）；浓度以百分浓度来表示的消光系数。百分消光系数等于浓度为1%，液层厚度为1cm的光密度值。
2．克分子消光系数（ε）；浓度以摩尔浓度来表示的消光系数。克分子消光系数等于溶液浓度为1个摩尔浓度，液层厚度为1cm的光密度值。
用消光系数计算浓度的公式是：

C=
D

(浓度单位为g/100ml) 或C=
D

(浓度单位为摩尔浓度)
E1%1cm
ε

例：一蛋白质溶液在其吸收峰λ=278nm处的光密度D=0.520，吸收杯厚度为1.00cm，已知E1%1cm278=5.10，则此蛋白质溶液的浓度为

C=
D

＝
0.502

=0.102%
E1%1cm
5.10

二、分光光度计的结构原理
不论光度计(Photometers)、比色计（Colorimenters）还是分光光度计(Spectrophoto- meters)，其基本结构原理都是相似的，都由光源、单色光器、狭缝、吸收杯和检测器系统等部分组成（图1-5）。
图1-5 光度计或分光光度计结构原理
（一）光源
一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮稳定、光谱范围广和使用寿命长等特点。几乎所有的光度计都采用稳压调控的钨灯(tungsten lamp)。它适用于做340-900nm范围的光源。更先进的分光光度计外加有稳压调控的氢灯(hydrogen lamp)。它适用于做200 -360nm的紫外分光分析的光源。
（二）单色光器
分光光度法测定某一物质的光密度需要在某一特定波长下进行。单色光器的作用在于根据需要选择一定波长范围的单色光。在实际工作中欲选择出单个某波长的光线是困难的。所谓单色光是指在此波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长范围内的发射能量较少而言。单色光的波长范围愈窄，仪器的敏感度愈高，测量的结果愈可靠。
图1-6 用棱镜产生单色光
最简单的单色光器是光电比色计上所采用的滤光片（一定颜色的玻璃片）。由于通过光线的光谱范围较宽，所以光电比色计的分辨效果较差，但对比色分析还是可以得到较为满意的效果的。棱镜(Prism)的衍射光栅(diffraction grating)是较好的单色光器。它们能在较宽光谱范围内分离出相对单一波长的光线（图1-6）
（三）狭缝
通过单色光器的发射光的强度可能过强也可能过弱不利于进一步检测。狭缝是由一对隔板在光通路上形成的狭缝。通过调节狭缝的大小来调节入射单色光强度并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的狭缝大小是可调的。
（四）吸收杯
吸收杯又叫样品杯(Sample Cell)，是光度测量系统的最重要部分之一。在可见光范围内测量时选用光学玻璃吸收杯，在紫外线范围内测量时要选用石英吸收杯。注意保护吸收杯的质量是取得好的分析结果的重要条件之一。不得用粗糙、坚硬物质接触吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光学面；用后要用水及时冲洗，不得残留测定液，尤其是蛋白质和核酸溶液。
（五）检测器系统
硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，将通过吸收杯的光线（I）的能量转变成电能。进一步再用适当的方法测量所产生的电流。
光电比色计用硒光电池为受光器。硒光电池的光敏感性低。它不能检出强度非常弱的光线。并且，对波长在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。
较精密的分光光度计都是采用真空光电管或光电倍增管作为受光器的，并采用放大装置以提高敏感度。虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的弱很多，但这种有放大线路的灵敏检测系统仍可能准确地检测出来。
三、几种常用的国产分光光度计
（一）721型分光光度计（图1-7）
图1-7 721型分光光度计示意图

这是一种采用光电管为受光器的较高级可见光分光光度计。由稳压电源供电的光源灯发出稳定的白光。如图1-7所示。光线经反射镜投入狭缝，再经准直镜反射进入棱镜，在棱镜中发生色散后，光线经铝面反射后，其中一部分经原路返回，并穿过狭缝，透过反射镜进入吸收杯。从吸收杯射出的光线再经光门射到光电管上，产生相应的电流，并经电流表指示出相应的刻度值。
其中色散棱镜装在一个可以转动的圆盘上，旋转波长选择钮可使之发生偏转，使不同波长的光线通过狭缝形成一定波长的单色平行光线。同时，波长盘也随之转动以指示波长数字。此型分光光度计给出360~800nm范围的波长，在410-710nm之间灵敏、适用。使用方法如下（各调节部位参看图1-8）。

图1-8 721型分光光度计外观

1．灵敏度选择钮放在“1”档（如调不到“0”时，再选用较高的档）。
2．转动波长选择钮，选用所需的波长。
3．接通电源（指示灯亮）。
4．揭开比色皿暗箱盖，转动“0”位钮，使电表指针对准T=0处。
5．将比色杯杯放入比色杯架上，使空白管对向光路，盖好比色皿暗箱盖，转动“百位钮”调准电表指针使之指向D=0（T=100处）。
6． 拉动比色皿座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出光密度值，记录。测读过程中，随时将拉杆推回到原位，使空白杯进入光路，并转动“百位钮”，使指针回到D=0处。
7． 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色皿暗箱盖盖好，清洗比色皿并空干。
8． 注意事项
（1）光电比色计属精密仪器，应精心爱护使用，要防震、防潮、防腐蚀。
（2）比色杯的好坏对光密度读数的影响很大，要保持比色杯的清洁干净，保护光学面的透明度，不能手握光学面，也不能用粗糙的物体接触光学面，比色杯中的液体应适量，不应过满，比色杯外壁的液体应用擦镜纸擦干，以防腐蚀仪器和影响读数。如比色液为强酸强碱，应尽快比色，以防破坏比色杯。
（3）比色时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳。如需连续使用，中间应适当暂停使用，使之避光休息。
（二）UV-754型分光光度计
这是一种可供在紫外到红外区（200-1000nm）测量吸收光谱的较高级分光光度计。此仪器的光学部分与721型分光光度计相类似，但它采用石英棱镜作单色光器，有钨丝灯和氢弧灯两种光源。754型分光光度计的电学部分较为复杂（图1-9）。光电流经过放大线路加以放大后，此时得到的样品信号变为与透光率成比例的值。其后，调零、变换对数、浓度计算、打印数据等均由微处理机进行。
仪器的使用方法
1．测试准备
（1）打开电源开关之前,检查一下试样室是否放置遮光物。
（2）试样槽置“参考”位置。
（3）接电源开关(如果波长工作在于200～360时需按氘灯触发按钮)。(参见图1-9)
显示器显示“754”后，数显而易见：“100.0”，则表示仪器已通过自检程序。
（4）仪器预热三十分钟后开始测试。
测试
（1）数显为100.0后，稳定2～3秒钟，即可把试样槽置“样品”位置进行测试。待第一个数据打印完毕后，再可将试样槽置第二个“样品”位置测试。
（2）每当需要调换波长时，必须把试样槽置“参考”位置，重新调满度。
[注意]：如果在幅度设定测试波长时，需等待数分钟后，才能工作，因这时光能量变化急剧，使光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间。

图1-9 UV-754 电气系统

第三节 层 析 技 术

层析技术是近代生物化学实验中常用的分析方法之一，任何层析过程都是在两个相中进行的。一是固定于支持物上的固定相，另一是流经固定相的流动相，由于样品中各组分理化性质（如溶解度、吸附能力、分子形状、分子所带电荷的性质和数量、分子表面的特殊基团、分子量等）不同，表现出对固定相和流动相的亲和力各不相同。当混杂物通过多孔的支持物时，它们受固定相的阻力和受流动相的推力也不同，各组分移动速度各异并在支持物上集中分布于不同的区域，从而各组分得以分离。
根据层析法中两相的性质和操作方法不同，层析法有许多类型，仅就几种常用的方法介绍如下：
一、吸附层析(Absorption Chromatography)
吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。吸附剂吸附能力的强弱与被吸附物质的化学结构、溶剂的本质和吸附剂的本质有关。当改变吸附剂周围溶剂成分时，吸附剂对被吸附物质的亲和力便发生变化，使被吸附物质从吸附剂上解脱下来，这一解脱过程称为“洗脱”或“展层”。
吸附层析是把吸附剂装入玻璃柱内（吸附柱层析法）或铺在玻璃板上（薄层层析法），由于吸附剂的吸附能力可受溶剂影响而发生改变，样品中的物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，改变吸附剂的吸附能力，使之解吸，随洗脱液向前移动。当解吸下来的物质向前移动时，遇到前面新的吸附剂又重新被吸附。此被吸附的物质再被后来的洗脱液解脱下来。经如此反复的吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程，物质即可沿着洗脱液的前进方向移动。其移动速度取决于吸附剂对该物质的吸附能力。由于同一吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而逐渐分离出来，这就是吸附层析的基本过程。
实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、florsit、活性钙、蔗糖、纤维素和淀粉。常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物，吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物。
值得提出的是，几乎所有的溶质对于所有的层析介质，即使是惰性的物质都有一定限度的吸附力，除吸附层析本身之外，吸附作用还或多或少地存在于所有其他类型的层析中。
二、分配层析（Partition Chromatography）
分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。
在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此类溶剂能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，使呈不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂。分配系数(a)是指在一定温度
和压力条件下达到平衡，物质在固定相和流动相两部分的浓度比值。
分配系数（a）=
物质在固定相中的浓度
物质在流动相中的浓度
在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移动。当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进行分配，一部分进入固定相。通过这样不断进行的流动和再分配，溶质沿着流动方向不断前进。各种溶质由于分配系数不同，向前移动的速度也各不相同。分配系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快。从而将分配系数不同的物质分离开来。
图1-10 纸层析示意图

支持物在分配层析中起支持固定相的作用，根据其使用方式也分柱层析和薄层层析两种。用滤纸做支持物的纸层析法是最常用的分配层析。实验中应选用厚度适当、质地均一、含金属离子(钙、铜、镁、铁等)尽量少的滤纸为支持物。滤纸中吸附着的水（约含20-22%）是常用的固定相。酚、醇是常用的流动相。展层方法多可采用垂直型（图1-10），也可采用水平型。把欲分离的样品点加于纸的一端，使流动相经此移动，这样在两相间就发生分配现象。根据样品中各组中的分配系数不同，它们就逐渐集中于纸上不同的部位。各组分在滤纸上的移动速度可用Rf值来表示。
Rf =
溶质层析点中心到原点中心的距离
溶剂前沿到原点中心的距离
在纸层析中，Rf值的大小主要取决于该组分的分配系数。分配系数大者移动速度慢，Rf值也小；反之分配系数小者移动速度快Rf值也大。因为每种物质在一定条件下对于一定的溶剂系统，其分配系数是一定的，Rf值也恒定。因此可以根据Rf值对分离的物质进行鉴定。
有时几种成分在一个溶剂系统中层析所得Rf值相近，不易分离清楚。这时可以在第一次层析后将滤纸吹干逆转90 o角，再采用另一种溶剂系统进行第二次层析，往往可以得到满意的分离效果。这种方法称为“双向纸层析法”（图1-11），以与一般的“单向纸层析”相区别。
图1-11 氨基酸双向纸层析色谱
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三、离子交换层析（Ion-exchange Chromatography）
离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的层析技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和一定离子强度的电解质溶液。
离子交换剂是具有酸性或碱性基团的不溶性高分子化合物，这些带电荷的酸性或碱性基团与其母体以共价键相连，这些基团所吸引的阳离子或阴离子可以与水溶液中的阳离子或阴离子进行可逆的交换。因此根据可交换离子的性质将离子交换剂分为两大类：阳离子交换剂和阴离子交换剂（图1-12）。
据离子交换剂的化学本质，可将其分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换葡聚糖等多种。
离子交换树脂是人工合成的高分子化合物，生化实验中所用的离子交换树脂多为交联聚苯乙稀衍生物。离子交换树脂多用于样品去离子，从废液中回收所需的离子和水的处理等。由于它可使不稳定的生物大分子变性，因此不适用于对生物样品进行分离。
图1-12 离子交换剂和它们所吸引的电荷

离子交换纤维素（图1-13）可用于生物大分子的分离。其缺点是分子形态不规则，孔隙不均一，对要求非常严格的试验尚不够满意。
CH2OCH2.CH2.N+H.(CH2CH3)2

图1-13 DEAE-纤维素部分结构
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较为理想的离子交换剂是离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶。它们具有颗粒整齐，孔径均一等优点，往往得到较好的分离效果。
根据各种离子交换剂所带酸性和碱性功能团的不同和其解离能力的差异，各种交换剂又可进一步分为强酸型、弱酸型、强碱型和弱碱型四种，现列于表1-4
表1-4 离子交换剂的类型及其功能基团
类 型
名 称
功 能 基 团
阳离子交换树脂
强酸型
Dowex 50
国产强酸1×7（732）
IR-120Zerolit 225

硫酸基 －SO3-
弱酸型
IRC-150Zerolit 226
国产弱酸101×128（724）
羟 基 －COO-
阴离子交换树脂
强碱型
Dowex 1 Dowex 2
201×7（713）及
国产 201×4（714）
Zerolit FF
IRA-400

季胺基 －N+R3
弱碱型
IR-45
Dowex 3
国产弱碱301（701）
Zerolith
伯胺基－N+H3
伯胺基－N+H2R
伯胺基－N+HR2
阳离子交换纤维素
强酸型
磷酸纤维素（P）
磺甲基纤维素（SM）
磺乙基纤维素（SE）
磷酸基－O－PO3-
磺甲基－O－CH2－SO3-
磺乙基－O－CH2－CH2－SO3-
弱酸型
羧甲基纤维素(CM)
羧甲基－O－CH2－COO-
阴离子交换纤维素
强碱型
三乙基氨基乙基纤维素
（TEAE）
三乙基氨基乙基
－O－CH2－CH2－N+－ (CH2CH3)3
弱碱型
二乙基氨基乙基纤维素
（DEAE）
氨基乙基纤维素（AE）
三羟乙基氨基纤维素（ECTEOLA）
二乙基氨基乙基
－O－CH2－CH2－N+H－ (CH2CH3)2
氨基乙基－O－CH2－CH2－N+H3
三羟乙基氨基－N+－ (CH2CH2OH)3
阳离子交换葡聚糖凝胶
强酸型
SE－葡聚糖凝胶G25
SE－葡聚糖凝胶G50
SP－葡聚糖凝胶G25
SP－葡聚糖凝胶G50
磺乙基－O－CH2－CH2SO3-

磺丙基－CH2SO3-
弱酸型
CM－葡聚糖凝胶G25
CM－葡聚糖凝胶G50
羧甲基－O－CH2－COO-
阴离子交换葡聚糖凝胶
强碱型
QAE－葡聚糖凝胶A25

QAE－葡聚糖凝胶A50
二乙基(α-羟丙基)氨基乙基
CH2 CH3
－O－CH2－CH2N+ CH2OH- CH3
CH2 CH3
弱碱型
DEAE－葡聚糖凝胶A25
DEAE－葡聚糖凝胶A50
二乙基氨基乙基
－O－CH2－CH2N+H－ (CH2CH3)2
离子交换层析的基本过程是：离子交换剂经适当处理装柱后，应该先用酸或碱处理（视具体情况可用一定pH的缓冲液处理），使离子交换剂变成相应的离子型（阳离子交换剂带负电并吸引相反离子H+，阴离子交换剂带正电并吸引相反离子OH-）加入样品后，使样品与交换剂所吸引的相反离子（H+或OH-）进行交换，样品中待分离物质便通过电价键吸附于离子交换剂上面（图1-14）。然后用基本上不会改变交换剂对样品离子亲和状态的溶液（如起始缓冲液）充分冲洗，使未吸附的物质洗出。洗脱待分离物质时常用的两种方法，一是制作电解质浓度梯度，即离子强度梯度。通过不断增加离子强

图1-14 离子交换分析基本过程举例

起始洗脱液
终未洗脱液
图1-15 梯度混合器

度，吸附到交换剂上的物质根据其静电引力的大小而不断竞争性的解脱下来；二是制作pH梯度，影响样品电离能力，也使交换剂与样品离子亲和力下降，当pH梯度接近各样品离子的等电点时，该离子就被解脱下来。在实际工作中，离子强度梯度和pH梯度可以是连续的（称梯度洗脱），也可以是不连续的（称阶段洗脱）。一般来讲，前者分离的效果比后者的分离效果理想，梯度洗脱需要梯度混合器来制造离子强度梯度或pH梯度。图1-15是最简单的梯度混合器，它由两个容器组成，两容器之间以连通管相连接，与出口连接的容器装有搅拌装置，内盛起始洗脱液，此洗脱液代表开始洗脱的离子强度（或起始pH）；另一容器内盛有终末洗脱液，此洗脱液代表洗脱的最后离子强度(或最后pH)。在洗脱过程中，由于终末洗脱液不断进入起始洗脱液中，并不断被搅拌均匀，所以流出的洗脱液成分不断的由起始状态向终末状态演变形成连续的梯度变化。
四、凝胶过滤(Gel Filtration)
凝胶过滤是利用具有一定口径范围的多孔凝胶的分子筛作用对生物大分子进行分离的层析技术。当样品随流动相经过由凝胶组成的固定相时，分子量大的物质不能扩散进入凝胶颗粒内部，于是随流动相流经颗粒之间的狭窄空隙，首先洗脱出层析柱；分子量小的物质可以扩散进入凝胶颗粒内部，比较大分子量物质流经的载面积宽，流动速度慢，于是与分子量大的物质分离开来，最后被洗脱出来（图1-16）。即固定相的网孔对不同分子量的样品成分具有不同的阻滞作用，使之以不同的速度通过凝胶柱，从而达到分离的目的，凝胶过滤又因此得名“分子筛层析”和“凝胶排阻层析”。
图1-16 凝胶层析分离层析图
（1）样品（其中含有大小不同的分子）溶液加在层析柱顶端；（2）样品溶液流经层析柱，小分子通过扩散作用进入凝胶颗粒的微孔中，而大分子则被排阻于颗粒之外。大、小分子因向下移动的速度发生差异而将大、小分子分离开来；（3）向层析柱顶加入洗脱液，大小分子分开的距离增大；（4）大分子已经流出层析柱。

在实际工作中，对于同一个凝胶柱来说，各种分子量的物质有其固定的洗脱体积。因此，准确掌握凝胶柱的一些基本因素是十分有益的。

凝胶柱的总体积（Vt）：凝胶颗粒之间空隙的体积（外水体积Vo）、凝胶颗粒网眼内的体积（内水体积Vi）和凝胶颗粒基质本身的体积（Vr）的总和（图1-17）。
Vt=Vo+Vi+Vr
如果被分离的物质分子量很大，完全不能进入网孔内，那末它从柱上洗脱下来（小样品时以洗脱峰为准）所需的洗脱液体积（Ve）就等于颗粒间隙的体积（Vo），即Ve=Vo。如果被分离物质的分子量极小，可以非常自由的通过网孔即进出凝胶颗粒，那么它的洗脱液体积就应当等于颗粒内和颗粒间隙体积的总和（Ve=Vo+Vi）。至于分子量位于上两者之间的，其洗脱体积便位于Vo和Vo+Vi之间。可见，分子量大小不同的物质，其洗脱体积不同从而可以用于物质的分离。另外，如果在有已知分子量的标准物质做对照的条件下，就可以根据洗脱体积来估计待测物质的分子量（图1-18）。
Vt Vo Vi
图1-17 凝胶过滤的Vt 、Vo 和Vi
Vr(凝胶粒本身体积)

图1-18 几种标准物质凝胶过滤图

Sephadex G-200（超细颗粒）柱2.6×70cm，洗脱液：0.05mol/L磷酸钾缓冲液，内含0.1 mol/LNaCl及0.02%NaN3，流速1ml/cm2/hr。
1．过氧化氢酶（210，000）
2．醛缩酶（158，000）
3．牛血清蛋白（67，000）
4．卵清蛋白（43，000）
5．糜蛋白酶原A（25，000）
6．核糖核酸酶A（13，700）
凝胶过滤除用于生物大分子的分离、分子量测定外，还可用于提纯、脱盐和复合物组分成分分析等。
适用于做凝胶过滤的材料有多种，主要有葡聚糖凝胶颗粒(SephadexG)、琼脂糖凝胶颗粒(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝胶颗粒(Bio Geip)等。现将这些凝胶颗粒的种类和某些应用数据列于表1-5。
不论何种凝胶，其共同特点是化学性质稳定，不带电，与待分离物质吸附力很弱，不影响待分离物质的生物活性，样品得率可