上课：课题3--血红蛋白的提取和分离.pptx

蛋白质蛋白质(protein)(protein)是生命的物质基础，是有机大分是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。者。没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的与。蛋白质占人体重量的16%20%16%20%，即一个，即一个60kg60kg重的成年人其重的成年人其体内约有蛋白质体内约有蛋白质9.612kg9.612kg。人体内蛋白质的种类人体内蛋白质的种类(zhngli)(zhngli)很多，性质、功能各很多，性质、功能各异，但都是由异，但都是由2020多种氨基酸多种氨基酸(Amino acid)(Amino acid)按不同比例组合按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的重要性蛋白质的重要性第一页，共三十一页。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要(zhyo)(zhyo)成分，负责运输成分，负责运输O2和和CO2第二页，共三十一页。课题课题(kt)(kt)3 3 血红蛋白的提取和分血红蛋白的提取和分离离第三页，共三十一页。一、基础知识一、基础知识（一）（一）蛋白质提取和分离蛋白质提取和分离(fnl)(fnl)的原理的原理（二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法 1、凝胶色谱法（分配色谱法）、凝胶色谱法（分配色谱法）2、电泳法、电泳法（三）缓冲溶液（三）缓冲溶液二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离第四页，共三十一页。根据蛋白质的物理化学性质差异根据蛋白质的物理化学性质差异(chy)(chy)：1.1.分子的形状、大小分子的形状、大小 2.2.电荷性质和多少电荷性质和多少 3.3.溶解度溶解度 4.4.吸附性质吸附性质 5.5.对其他分子亲和力对其他分子亲和力 （一）（一）思考：思考：蛋白质的种类多种多样，进行蛋白质的种类多种多样，进行(jnxng)(jnxng)蛋白质蛋白质提取与分离的原理是什么？提取与分离的原理是什么？第五页，共三十一页。1 1、凝胶色谱法（分配、凝胶色谱法（分配(fnpi)(fnpi)色谱法）色谱法）小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程(lchng)(lchng)长，流动慢；长，流动慢；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快。凝胶凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的糖）构成的多孔小球体多孔小球体，内部有许多，内部有许多(xdu)(xdu)贯穿的通道。贯穿的通道。根据根据 分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法。（1）概念：）概念：（2）材料：）材料：（3）原理：）原理：（二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法相对分子质量的大小相对分子质量的大小第六页，共三十一页。第七页，共三十一页。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 第八页，共三十一页。2 2、电泳、电泳(din yn)(din yn)法法（2 2）原理）原理(yunl)(yunl)：带电粒子带电粒子在在电场电场(din chng)(din chng)的作用的作用下发生下发生迁移迁移的过的过程。程。（1 1）电泳：）电泳：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，团，在一定的在一定的PHPH下，这些基团会带上正电或负电。下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反相反的电极移动。的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。（二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法第九页，共三十一页。电电泳泳(d di i n n y y n n)原原理理示示意意图图第十页，共三十一页。思考：影响思考：影响(yngxing)(yngxing)蛋白质分子运动速度的因素蛋白质分子运动速度的因素决定决定运动方向运动方向电场电场作用力作用力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小第十一页，共三十一页。（3）常见(chn jin)(chn jin)电泳方法有哪些？琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳（4）实例(shl)(shl)通常(tngchng)(tngchng)使用：十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。应用第十二页，共三十一页。（三）缓冲溶液（三）缓冲溶液(hun chn rn y)(hun chn rn y)抵制(dzh)(dzh)外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，如如HH2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等。等。调节缓冲剂的使用(shyng)(shyng)比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。1 1、作用：、作用：2 2、配制：、配制：第十三页，共三十一页。二、实验操作二、实验操作(cozu)实验步骤实验步骤1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 透析透析样品样品处理处理纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定粗分离粗分离 凝胶色谱法凝胶色谱法 SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳谱法凝胶电泳谱法第十四页，共三十一页。血液(xuy(xuy)第十五页，共三十一页。血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90）两个a肽链两个一肽链四个亚铁红素基团血液(xuy)(xuy)的组成第十六页，共三十一页。二、实验二、实验(shyn)操作实验操作实验(shyn)步骤步骤1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 样品样品(yngpn)处理处理第十七页，共三十一页。1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞阅读阅读(yud)思考：洗涤的思考：洗涤的目的是目的是什么？洗涤的什么？洗涤的方法方法是什是什么？洗涤么？洗涤干净的标志干净的标志是什么？是什么？血液血液(xuy)100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积倍体积生理盐水生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，次，直至直至(zhzh)上清液没有黄色上清液没有黄色第十八页，共三十一页。2.释放释放(shfng)血红蛋白血红蛋白阅读思考：阅读思考：1.释放释放(shfng)血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？作用是什么？些物质？作用是什么？2.搅拌的目的是什么？搅拌的目的是什么？分析：分析：1.蒸馏水蒸馏水的作用的作用(zuyng)是是_。2.加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。3.充分充分搅拌搅拌的目的是的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂第十九页，共三十一页。滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质3.3.分离分离(fnl)(fnl)血红蛋白血红蛋白 红细胞红细胞 混合液混合液高速离心高速离心10min 10min 烧杯烧杯有机溶剂有机溶剂血红蛋白血红蛋白分液漏斗分液漏斗第二十页，共三十一页。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液4.透析透析 透析的目的透析的目的(md)(md)是什么？是什么？1mL1mL1mL 去除样品中的去除样品中的分子分子(fnz)(fnz)较小的较小的杂质。杂质。第二十一页，共三十一页。第二十二页，共三十一页。纯化纯化(chn hu)凝胶色谱法凝胶色谱法1.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的制作：柱的制作：2.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的装填：柱的装填：3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱教材教材P68图图5-19第二十三页，共三十一页。注意注意：装填装填(zhun tin)(zhun tin)尽量紧密，降低颗粒间隙；尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。无气泡；洗脱液不能断流。思考：你能从凝胶色谱的分离原理思考：你能从凝胶色谱的分离原理(yunl)(yunl)分析为什分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀，无气泡？么凝胶的装填要紧密、均匀，无气泡？扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离(fnl)(fnl)效果。效果。第二十四页，共三十一页。3.样品的加入样品的加入(jir)和洗脱和洗脱 1.1.调液面调液面 2.2.加样加样 3.3.再调液面再调液面 4.4.洗脱洗脱(x tu)(x tu)5.5.收集收集(shuj)(shuj)缓冲液缓冲液凝胶凝胶第二十五页，共三十一页。正确的加样操作正确的加样操作(cozu)(cozu)是：是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第二十六页，共三十一页。讨论(toln)(toln)：答：除去(ch q)(ch q)相对分子量较大的蛋白质。1、纯化的目的(md)(md)是什么？答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？第二十七页，共三十一页。知识知识(zh shi)总结总结血血红红蛋蛋白白(xuhng dnbi)的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定第二十八页，共三十一页。例题例题:红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是血红蛋红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳。我白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题(wnt)(wnt)：（1 1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：、和和 。（2 2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是加入柠檬酸钠的目的是 。以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括 、收集血红蛋白溶液。、收集血红蛋白溶液。第二十九页，共三十一页。（3 3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。就是样品的粗分离。透析的目的是透析的目的是 。透析的原理是透析的原理是 。（4 4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行(jnxng)(jnxng)纯度鉴定。纯度鉴定。样品纯化的目的是样品纯化的目的是 。血红蛋白有什么特点血红蛋白有什么特点:这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？第三十页，共三十一页。内容(nirng)总结蛋白质(protein)是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要成分，负责运输O2和CO2。1、凝胶色谱法（分配色谱法）。二、实验操作蛋白质的提取和分离。凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极(dinj)移动第三十一页，共三十一页。