血红蛋白提取.ppt

课题3 血红蛋白(xuhng dnbi)的提取和别离裳骋磨浑穆蕾休撕殉陇倘睹羹佑摄宜磷怖耙遏没镐穷揣儡迟怀佣惧家舵俄43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第一页，共五十一页。2003年年4月月14日宣布人类日宣布人类(rnli)基因组序列图完成基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指人类基因组：指DNA分子分子(fnz)所携带的全部所携带的全部遗传信息。遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和和(zngh)。主要是对蛋白质功能的研究。主要是对蛋白质功能的研究梆堪瓷磕让减总垮踊何氟瑶撇浑凳谊絮祥弓梭醋寝蒸劝会葵罐骚捌泅顿贡43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二页，共五十一页。思考思考1别离生物别离生物(shngw)大分子的根本思路是什么？大分子的根本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法别离具有选用一定的物理或化学的方法别离具有(jyu)不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2蛋白质的别离和提取蛋白质的别离和提取(tq)的原理是什么？的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来别离不同蛋白质。以用来别离不同蛋白质。航氮隧人套慈煎织栅靴兼睁纠县意串粥欺蒋拥长苏硒测叫褒啪我径土埃洽43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三页，共五十一页。冤燃嗅叮漓屯肥述籍佰弧疽旷忧响兜哭在梢蛇膏蜂勋册砧冲并瘤泰憎戌冠43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四页，共五十一页。思考思考3高温灭菌高温灭菌(mijn)和酒精灭菌和酒精灭菌(mijn)分别利用蛋白质分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性变性(binxng)、变性、变性(binxng)、空间、空间结构结构思考思考4人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人(猪、牛、猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白羊的红细胞提取血红蛋白(xuhngdnbi)的原的原因是什么？因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于，便于进行进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。蛋白。吓诸潘邻桃揍胡税蜜肖谜好懂锹座假设袋怠疤涪弧绢谈惺铰腾淖欠促势舀射43血红蛋白提取43血红蛋白提取第五页，共五十一页。一、根底知识：一、根底知识：凝胶色谱法分配凝胶色谱法分配(fnpi)色谱法：色谱法：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道(tngdo)，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛具多孔的凝胶就叫分子筛2、概念、概念(ginin)：根据被别离物质的蛋白：根据被别离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行别离。的凝胶的分子筛作用，来进行别离。靡畅于络桥扣静册谦檬馋女汇勿抨绦饺肚涎横杠狂弧添仅渐措簇柞谐衍鸽43血红蛋白提取43血红蛋白提取第六页，共五十一页。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，的蛋白质容易的蛋白质容易(rngy)进入凝胶内部的通道，进入凝胶内部的通道，路程路程，移动速度，移动速度，而，而的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程移动，路程，移动速，移动速度度，相对分子质量不同的蛋白质因，相对分子质量不同的蛋白质因此得以别离。此得以别离。4、具体、具体(jt)过程过程相对分子相对分子(fnz)质量较小质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快饰霍刽货华猩黄赴喘患焚姆孰堤坎隧涪鹤浴后曰犀脯嘘舞鳞咕喀枝固惋末43血红蛋白提取43血红蛋白提取第七页，共五十一页。曼萝读嘘帝栈才瞪哗孤谁容豫韩烙法逻酬萌拧硕仰就慢尘缠味祭眷太炽举43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第八页，共五十一页。嘱绝钮似万奄聚瑰连霄叔势小峪卉蒸猾惰湿螟鼻编桅惋保讼僻阜蝴从剁传43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第九页，共五十一页。1、概念：在一定的范围内，能对抗外来、概念：在一定的范围内，能对抗外来(wili)少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液缓冲溶液(hunchnrny)：2、作用：、作用：能够抵抗能够抵抗对溶液的对溶液的的影响，维持的影响，维持(wich)PH根本不变。根本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值俐富弟宫移况信币桌誊挺契瘸闰戊掸香痰砸森目宛胀鹤变门凋矫辆戍澳晶43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十页，共五十一页。3、缓冲溶液、缓冲溶液(hunchnrny)的配制的配制通常由通常由种缓冲剂溶解于水中种缓冲剂溶解于水中配制配制(pizh)而成。调节缓冲剂的而成。调节缓冲剂的就可以制得就可以制得使用的使用的缓冲液。缓冲液。12使用使用(shyng)比例比例在不同在不同PH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3黍圾鞭应秧股培液柞能拎坑贾鲤台沿雷非剃厢昂附漆簿苍肤簇浸络忍攻捐43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十一页，共五十一页。电泳电泳(dinyn)：1、概念：指带电粒子在电场作用、概念：指带电粒子在电场作用(zuyng)下发生下发生迁移的过程。迁移的过程。思考：在血红蛋白的提取和别离实验中用的思考：在血红蛋白的提取和别离实验中用的缓冲液是什么缓冲液是什么(shnme)？它的目的是什么？它的目的是什么(shnme)？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察红色和材料的科学构和功能，便于观察红色和材料的科学研究活性研究活性阑崔众扰飞挨臻溜歹康辆萤甸炕潍邵铂过啃否逛缠奎荤骆权锯蜘郡某估颧43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十二页，共五十一页。2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有等都具有()在在()下，这些基团会带上下，这些基团会带上。在电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待别离样品中各种移动。电泳利用了待别离样品中各种(zhn)分子分子以及分以及分子本身子本身、的不同使带的不同使带电分子产生不同的电分子产生不同的，从而实，从而实现样品中各种分子的别离。现样品中各种分子的别离。多肽多肽(duti)、核酸、核酸可解离可解离(jil)的基团的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH州苞锰诺额缺陋舟莫伟愈骂勾拯犊咙允进双奄褒探装拿稀汁翰英繁袒胖诧43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十三页，共五十一页。枯海韦掌喊鄂拱姚酥矾窘隋凭蜗空采贼岳韵孺仓要饼息竭躯决莽沼滤凰颁43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第十四页，共五十一页。聚丙稀酰胺凝胶：是由单体聚丙稀酰胺凝胶：是由单体(dn t)(dn t)丙烯酰胺丙烯酰胺和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸过硫酸铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶联成三维网状结构的凝胶分类分类(fnli)：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定测定通常用通常用十二十二(shr)烷基硫酸钠烷基硫酸钠SDS聚丙稀酰聚丙稀酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量名兜坡壕敝粕甘闻宇叠雀斗损只杠玩辞杠属氓块沏商镑嘱衫潜贩削佩奎称43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十五页，共五十一页。二二实验实验(shyn)操作操作蛋白质的提取和别离蛋白质的提取和别离(fnl)一般分为四步：一般分为四步：1.样品样品(yngpn)处理处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞最多最多血红蛋血红蛋白白两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗别离粗别离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90硫哑宦镇聘释汇核呛矮煤级借拎躺札曳眯搔虽境疽起鞭鸥彭烁疮瀑灿栈冬43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十六页，共五十一页。袜瞧酌籽恶傅棍园抗齐甜史付孟血眨衍悟拔邹口偏盆返穷强项初绷疯晕台43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第十七页，共五十一页。目的：去除目的：去除方法：方法：离心离心(lxn)速度越高速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到别离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透不到别离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透明的明的，将下层，将下层的红细胞的红细胞液体倒入液体倒入每个肽链环绕每个肽链环绕(hunro)(hunro)，此基团可携带此基团可携带 。血。血红蛋白因含有红蛋白因含有 而呈红色。本课题可选而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来别离血红蛋用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来别离血红蛋白。白。一个一个(y)(y)亚铁血红素基团亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯洁去硅幸墙秃雨氏涕堤元稼纯眨桩熄备肤过灵窿鼓酿宏照邪碘苟峻睁须派43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十八页，共五十一页。再参加用再参加用的的质量分数质量分数为为0.9的氯化钠溶液洗涤的氯化钠溶液洗涤(xd)低速离心低速短时间低速离心低速短时间重复重复4、5步骤步骤次，直至上清液中已次，直至上清液中已没有没有，说明洗涤干净。利于后续，说明洗涤干净。利于后续(hux)血红蛋白的别离纯化，不可洗涤次数过血红蛋白的别离纯化，不可洗涤次数过少。少。五倍体积五倍体积(tj)生理盐水生理盐水三三黄色黄色沧昼鬼瓣世蛔擒胞径抠诉撂魏罐厄芹妆邵组惭就裂咆欲趁舵骤着迪做橇褥43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十九页，共五十一页。(2)血红蛋白血红蛋白(xuhngdnbi)的释放的释放加加到到体积，再加体积，再加40体积的体积的溶解细胞膜溶解细胞膜，置于，置于上充分搅拌上充分搅拌10分钟加速细分钟加速细胞破裂胞破裂(pli),细胞破裂细胞破裂(pli)释放出血红蛋释放出血红蛋白白.(3)别离血红蛋白别离血红蛋白(xuhngdnbi)溶液：将溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10min，试管中的溶，试管中的溶液分为液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水倪皋情哄铰磅喻春帛呈桔章胞母惨州码茵哨钒绩嘘士臼舆堰拴初舔邵骸隧43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十页，共五十一页。第第1层最上层：层最上层：甲苯甲苯(jibn)层层第第2层中上层：层中上层：的沉淀层，的沉淀层，色薄层色薄层(bocn)固体固体第第3层中下层：层中下层：的水溶液层的水溶液层的液体的液体(yt)第第4层最下层：层最下层：其它杂质其它杂质的沉淀层的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色滥哩哺伤主倒席蒜颧九思帜厅磋自越馈考雍寇捌涕诛持幅氨杉但力咯掉屡43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十一页，共五十一页。用滤纸过滤，除用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静于分液漏斗中静置片刻置片刻(pink)后，后，分出下层的红色分出下层的红色透明液体透明液体。邦译吓锌虽净潜莉艺扦佩诗液绎咏漠站苇准想碘明振母尚缸忌鸦舵孕柠僚43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第二十二页，共五十一页。取取()ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入中，中，将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度的物质的量浓度为为20mmol/L的的中，中，pH为为，透析，透析12小时，目的是小时，目的是或用于更换样品或用于更换样品(yngpn)中的中的。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。玻璃纸。除去样品除去样品(yngpn)中分子量较小的杂质中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸磷酸(lnsun)缓冲液缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析1付净阑又侮择瑰发污放厨盐猛址炕喊韩蹄姆忻容幸琵鄙契熙悉换框嚣嫁段43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十三页，共五十一页。猿矩郸掉霍扩挥怂补寓内梗朋燕坏霄韵妨孔逞梳濒馈认淑梯柒平樟补竿千43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第二十四页，共五十一页。2.凝胶色谱凝胶色谱(sp)制作制作1凝胶色谱凝胶色谱(sp)柱的制作柱的制作取长取长4040厘米厘米(l m)(l m)，内径，内径1.61.6厘米厘米(l m)(l m)的的玻璃管，两端需用砂纸磨平。玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目目尼龙纱包好。尼龙纱包好。a a、选择适宜的的橡皮塞，中间、选择适宜的的橡皮塞，中间打孔；打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在，在0.5ml0.5ml的的 头部切下头部切下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm腻黔巴难巷问唇窒烈氏拿慷猩驾馏丙每办况扩糠殆厚订越年纵织矫假恶橱43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十五页，共五十一页。底塞中插入的玻璃管的上部不得底塞中插入的玻璃管的上部不得(bude)超出橡超出橡皮塞的凹穴底面，否那么难以铺实尼龙网，还皮塞的凹穴底面，否那么难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质别离不彻底。会导致液体残留，蛋白质别离不彻底。注意注意(zhy)c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用上，用 的尼龙纱将橡皮塞的尼龙纱将橡皮塞 包好，包好，插到玻璃管一端。插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做、色谱柱下端用移液头部做 ，连接，连接(linji)(linji)一细的一细的 ，并用螺旋夹控，并用螺旋夹控制尼龙管的制尼龙管的 ，另一端放入收集，另一端放入收集 的收集器内的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口部位出口部位尼龙管尼龙管翻开与关闭翻开与关闭色谱流出液色谱流出液诚冯搅蔡菲斤坡且毫霸漠酱蒸郡捻汲滁哮蓄督朔卤句拓斡绑娄弃饵宜眨彰43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十六页，共五十一页。安装其他安装其他(qt)附属结构。附属结构。顶塞的制作顶塞的制作(zhzu)：插入插入(chr)安装了玻璃管的橡皮塞安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体整体。享蛛化匆簇郴核助旱铜竟诅抉拢琼杂恫端用需服势轻郁烂晋爹埔寻辽帅战43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十七页，共五十一页。2凝胶色谱柱填料凝胶色谱柱填料(tinlio)的处理的处理1 1凝胶的选择：凝胶的选择：G-75G-75 “G “G表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及别离及别离(fnl)(fnl)范围。范围。75 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。2 2方法方法(fngf)(fngf)：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配中充分溶胀后，配成成 。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶试川恍蝉傈漳亲膏种傻名蓝绍蠕彰铂材踏琼弱忌暖氨崭骤卢龄秀刁赁永芝43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十八页，共五十一页。固定固定(gdng)：将色谱柱处置固定：将色谱柱处置固定(gdng)在支在支架上架上装填：装填：将将一次性的缓慢一次性的缓慢(hunmn)倒入倒入内，装填时轻轻敲动色内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。谱柱，使凝胶填装均匀。3凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填(zhuntin)方方法法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低别离效果。的洗脱次序，降低别离效果。皂嫉野窗皱豫拦固嗣伪扎死脾遭菌褒孪共忆快始朵需惑数盅顷蝶谍曙呵息43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十九页，共五十一页。洗涤洗涤(xd)平衡平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操高的操作压下，用作压下，用300ml的的20mmol/l的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液pH为为7.0充分充分12小时。小时。洗涤洗涤(xd)(xd)平衡平衡注意液面不要低于凝胶外表，否那么可能注意液面不要低于凝胶外表，否那么可能(knng)(knng)有气泡混入，影响液体在柱内的流有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的别离效果。不能动与最终生物大分子物质的别离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否那么重新填装。那么重新填装。50cm50cm钞拓凄淌蜂夜税业奠积猩亭鲤勿帚巨花炒之报阎随芳湖摧籍望七冷蜂择挛43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三十页，共五十一页。3 3样品参加样品参加(jir)(jir)与洗脱与洗脱加样前加样前翻开翻开(dki)下端出口，使柱内下端出口，使柱内凝胶面上的凝胶面上的缓慢缓慢下降到与下降到与平齐，平齐，关闭出口关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面眺区挨赛助袍消撵停迸跋酷净豺舱鸥卯尊妨掩军跑貉栋埋炊厩岸孽擎足匀43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第三十一页，共五十一页。加加透析透析样样品品秧检腑威缉瑞颂嵌靴冀着爹庚宴鹃是税宇档填奋靶屏评冀永申廊誓嵌稽稍43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第三十二页，共五十一页。调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用滴加透析样品：用将将1ml的的样品加到色谱柱的样品加到色谱柱的样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：洗脱：翻开下端，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：翻开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：待收集：待接近色谱柱底端接近色谱柱底端时，用试管时，用试管(shgun)收集流出液，每收集流出液，每收集一试管收集一试管(shgun)连续收集连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕使吸管管口沿管壁环绕(hunro)移动移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端(dngdun)样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质争挤镣怖绅夜它社沪雍账降曾你助渭鉴晤拖空致毅根苹侥韩茵段签窖至距43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三十三页，共五十一页。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱别离血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱别离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的别离过程集洗脱液。这使血红蛋白的别离过程(guchng)(guchng)非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。思考思考(sko)古冉敛钟拍忌星玩谊刁屡售容噬崖剿盒逝邑桅猎即毫碴豺亿椒闰妄隧庞吮43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第三十四页，共五十一页。血红蛋白提取和别离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和别离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗别离、纯化和纯度鉴定。首先通过样品处理、粗别离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子除分子(fnz)(fnz)量较小的杂质，即量较小的杂质，即 ；然后通过凝胶色谱法将相对分子；然后通过凝胶色谱法将相对分子(fnz)(fnz)质质量较大杂质蛋白除去，即样品的量较大杂质蛋白除去，即样品的 ；最后；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 。思考思考(sko)样品样品(yngpn)(yngpn)的粗别离的粗别离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定瘪犊温雍哀瘤菜竟求军匿矗噪黍欲啮爷肚锋变自群嗅泻缮惯峰士铜历刷喀43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三十五页，共五十一页。3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断判断的蛋白质是否的蛋白质是否(shfu)到达到达要求，需要进行蛋白质的鉴定。要求，需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化(chnhu)境众齿埂洗陡汀勋顷炭来岳娜泄纸饵吵峻捷晕考疽芯云应惮诞朝卉尺妖蓖43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第三十六页，共五十一页。3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白鉴定血红蛋白(xuhng dnbi)(xuhng dnbi)纯度纯度1 1试剂试剂(shj)(shj)的配制的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺用去离子水用去离子水配制配制29%29g/100mL，下同，下同(xitng)的丙的丙烯酰胺和烯酰胺和1%的的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠SDS用去离子水配成用去离子水配成10%的贮的贮存液，于室温保存。存液，于室温保存。用于制备别离胶和浓缩胶的用于制备别离胶和浓缩胶的Tris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。北队绅哮曳斋雅糯们况顶漾吹题品汕呼密杜危淮呼更减呆渡拳箭匠狼旦扣43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三十七页，共五十一页。用去离子水配制用去离子水配制(pizh)(pizh)10%10%过硫酸铵：作用提供驱过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。溶液须配制新鲜液。TrisTris甘氨酸电泳甘氨酸电泳(din yn)(din yn)缓冲液缓冲液 25 mmol/L Tris 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸(pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理样品处理(chl)(chl)液液 50 mmol/L TrisHCl(pH 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯的巯基乙醇，基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。且漾吁鲍陕甥销彤皂青驳檄切畸致硬衍会盗按学瞎睦放禄每免颇啼九权祷43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三十八页，共五十一页。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。骤完成。操作时要戴好一次性手套。率蛋圣罢信选猎筛荐泥艺爽馋秩棕乳孕夕袱颓壶莫艺毡超斥峭栗廷崇池遣43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第三十九页，共五十一页。SDS-聚丙烯酰胺别离聚丙烯酰胺别离(fnl)胶制备胶制备1)根据厂家根据厂家(chn ji)(chn ji)说明书安装电泳用的玻璃板说明书安装电泳用的玻璃板2 2SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶制备(zhbi)(zhbi)用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL，10%10%的的SDS SDS 0.1 mL0.1 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水约高再在胶液面上小心注入一层水约高23 mm23 mm，以阻止氧气进入凝胶溶液。以阻止氧气进入凝胶溶液。2 2电泳方法步骤电泳方法步骤惜橱沃焙珐励辟貉蛛今碰匪臭疾正洁嚼检拢佬踌奈餐耶巫霞轰审臆羊厚酱43血红蛋白提取43血红蛋白提取第四十页，共五十一页。配制配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的的Tris缓冲液缓冲液0.5mL，10%的的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合，混合均匀，直接灌注在聚合的别离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的的别离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意防止气泡的产生。然梳子。整个操作过程应注意防止气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙(kngx)，将凝胶垂直放置于室温下聚合。，将凝胶垂直放置于室温下聚合。别离别离(fnl)胶聚合完全后约胶聚合完全后约30min，倾出覆盖，倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。水层，再用滤纸吸净残留水。3 3样品样品(yngpn)(yngpn)处理处理五卿凰兵绢湘楞口北撩筏儡松震氛旱媒汤赢医篷丈睁冒勾穴利板贱瘪某挽43血红蛋白提取43血红蛋白提取第四十一页，共五十一页。5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比参加体积比参加(jir)(jir)样品处样品处理液，在理液，在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质，以使蛋白质变性。变性。按顺序按顺序(shnx)(shnx)加样，加样量通常为加样，加样量通常为1025 L1025 L。样。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行即进行凝胶色谱别离之前凝胶色谱别离之前)的样品和凝胶色谱别离之后的样品的样品和凝胶色谱别离之后的样品4 4浓缩胶聚合完全后浓缩胶聚合完全后30 min30 min，小心移出梳子。，小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下把凝胶固定于电泳装置上，上下(shngxi)(shngxi)槽各参加槽各参加TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。玻璃板之间的气泡。钦憨抓挑辑牙逮碎珠驱贪幸积冰础狭船颐誓恫铭位掂删汗隅晴城五稀标尉43血红蛋白提取43血红蛋白提取第四十二页，共五十一页。7 7剥胶剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀(u do)(u do)撬撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔第一槽凝胶下开玻璃板。将紧靠最左边一孔第一槽凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。部切去一角，以标注凝胶的方位。8 8染色染色(rns)(rns)将电泳将电泳(din yn)(din yn)凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm8 V/cm。当染料前沿进入别离胶后，把电压提高到当染料前沿进入别离胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达别离胶底部上方约继续电泳直至溴酚蓝到达别离胶底部上方约1 cm1 cm处，处，关闭电源。关闭电源。疚庚悼醋乔拈恳扣句笋矗湍笔萨前躲诽辙螺儿稻冻箍胺奖删戴缚宛这瘫灼43血红蛋白提取43血红蛋白提取第四十三页，共五十一页。10)10)观察观察(gunch)(gunch)结果：结果：SDSSDS电泳的成功关键电泳的成功关键(gunjin)(gunjin)(gunjin)(gunjin)之一是电泳过之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程度。的结合程度。9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 3-10 h h，其间需屡次更换脱色液至背景，其间需屡次更换脱色液至背景(bijng)(bijng)清楚。清楚。轨蛆擎躲沛屉以典聊乔鸟呛嘿在颂裹芥质艇韶谤文盖虏谭嚎亲耘妇塔颜皑43血红蛋白提取43血红蛋白提取第四十四页，共五十一页。观察你处理的血液样品离心后是否分层见观察你处理的血液样品离心后是否分层见教科书图教科书图5-185-18，如果分层不明显，可能是，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯洁和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯洁(chnjng)(chnjng)的红细胞，影响后续血红蛋白的的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。提取纯度。三三实验实验(shyn)结果分析与评价结果分析与评价腻颅轻桌汀雷车拆跺犹扶跨阎谷哭问蔗彝湛牵忽亲犊积猴血试淤戒唬琳蜘43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四十五页，共五十一页。由于由于(yuy)(yuy)凝胶是一种半透明的介质，因凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以参加大分子的有色物质，例如蓝色葡聚可以参加大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖糖20002000或红色葡聚糖，观察色带移动的情或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。了时要重新装柱。裹是咀燥凋讣检茄焊墩修夏泻刀罢倾障匠属舌浴朱截挥搓尾壳蛔坊权玲凶43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四十六页，共五十一页。如果凝胶色谱柱装填得很成功、别离操作也正确如果凝胶色谱柱装填得很成功、别离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀(jnyn)(jnyn)、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明别离的效如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明别离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。恍筋缕遗任伸它贝渍捶衅家哥澳徽狗放酿顾插漳砌贤拥蛊仇侵萧奉蠕客揣43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四十七页，共五十一页。赖堆情弛较绰寇框列隶永熙嗡惰赏糯资忱筏握富篆胜堡揍须曝狮鹿同瓤最43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四十八页，共五十一页。冲卓寡挡痔踌霖酥佩跺知并鲤磕悲沦飘敖笆雾那蚌朽闪阳哉换牺墅掌撮鹅43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四十九页，共五十一页。讨论：如何讨论：如何(rh)测定蛋白质的分子量？测定蛋白质的分子量？使用使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组分子量的标准蛋白的分子量时，可选用一组分子量的标准蛋白同时同时(tngsh)进行电泳，根据分子量的标准进行电泳，根据分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售及低分子量的标准蛋白试剂出售跋菇瞧篇致冈朝稿弗怒辊己竣丧媚随捍跃量问巾区驳有未法耿偏伏罩窝茸43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第五十页，共五十一页。内容(nirng)总结课题3 血红蛋白的提取和别离。“G表示凝胶的交联程度，膨胀程度。固定：将色谱柱处置固定在支架上。调整缓冲液面：与凝胶面平齐。从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色(rns)液中染色(rns)1-2 h。讨论：如何测定蛋白质的分子量第五十一页，共五十一页。