大肠细菌的基因芯片鉴定.pptx

实验三基因芯片鉴定大肠细菌 基因芯片基因芯片：是指将特定的是指将特定的DNADNA或寡聚或寡聚核苷酸核苷酸片段通过片段通过物理化学物理化学方法固方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上定于玻璃、尼龙甚至塑料片上,使多基因分析可同时进行的一使多基因分析可同时进行的一种装置。种装置。基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经提取并经PCR扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。探针位点上，说明样品来自于该物种。基因芯片上固定探针的方法 通通过过化化学学修修饰饰可可以以使使玻玻片片成成为为表表面面富富含含氨氨基基的的基基片片。在在中中性性溶溶液液中中，基基片片上上的的氨氨基基所所带带的的正正电电荷荷与与核核酸酸分分子子上上的的磷磷酸酸所所带带的的负负电电荷荷相相互互作作用用，使使核核酸酸吸吸附附在在基基片片表表面面。加加热热和和紫紫外外照照射射可可以以增增强强固固定定效效果果，但但紫紫外外交交联联容容易易导导致致DNADNA断断裂裂或或DNADNA分分子子间间形形成成干干扰扰杂杂交交的的网网状状结结构构，所所以以一一般般还还是是采采用用加加热固定。热固定。本本实实验验使使用用的的基基因因芯芯片片上上固固定定有有大大肠肠杆杆菌菌HSP70HSP70基基因因和和黄黄单胞菌单胞菌HTPGHTPG基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。基因芯片制作和检测的原理实验方案 本实验共分为四个部分：本实验共分为四个部分：一、大肠杆菌培养一、大肠杆菌培养 二、提取大肠杆菌基因组二、提取大肠杆菌基因组DNA 三、三、PCR扩增其扩增其HSP70基因，电泳检测扩增产物基因，电泳检测扩增产物 四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号第一部分 细菌培养 配制配制100ml LB液体培养基，蛋白胨液体培养基，蛋白胨1g，酵母提，酵母提取物取物0.5g，氯化钠，氯化钠1g，加重蒸水，加重蒸水100ml，用，用NaOH调调pH至至7.0，高压灭菌。，高压灭菌。将大肠杆菌单菌落接种于将大肠杆菌单菌落接种于LB培养基中，培养基中，37恒恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为温摇床上培养过夜，摇床转速约为280r/min。第二部分提取纯化大肠杆菌基因组DNA第二部分 实验步骤1、取培养的菌液取培养的菌液10ml，4000r/min离心离心10min，除去上清液。，除去上清液。2、加入、加入1ml TE，使细菌沉淀充分悬浮。，使细菌沉淀充分悬浮。3、加入、加入0.2ml 10%SDS 溶液，再加入溶液，再加入10l 20 mg/ml 蛋白酶蛋白酶K，37水浴中温育水浴中温育1h。(SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。)4、取出离心管，加入、取出离心管，加入0.2ml 5mol/L NaCl 溶液，混匀后再加入溶液，混匀后再加入0.2ml CTAB/NaCl 溶液，溶液，65水浴中温育水浴中温育20min。5、加入与菌液等体积（、加入与菌液等体积（1.6ml）的苯酚）的苯酚/氯仿氯仿/异戊醇混合液，异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，4000r/min离心离心10min。注意吸取混合液前。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。将混合液充分振荡混匀。6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇混异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，合液，用移液器反复吹打混匀，4000r/min离心离心10min。7、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入2l RNase A，37水浴中温育水浴中温育30min。8、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。抽提残留在水相中的苯酚。4000r/min离心离心10min。9、将上清液移至新的离心管中。、将上清液移至新的离心管中。10、加入上清液、加入上清液1/10体积的体积的3mol/L NaAc溶液，以及溶液，以及上清液上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀DNA。室温下静置室温下静置10min，DNA形成白色（或淡黄色）絮状形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。沉淀。11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装有适量有适量75%乙醇的乙醇的1.5ml离心管中上下颠倒漂洗，洗离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。去杂质。7500r/min离心离心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于、去上清液，沉淀干燥后溶解于100l TE中。中。取取10l提提取取的的基基因因组组DNA溶溶液液加加1.99ml水水稀稀释释后后测测量量OD260，蒸蒸馏馏水水作作为为空空白白，计计算算DNA产产量量（1 OD26050g DNA/ml）。）。-20贮贮存存其其余余基基因因组组DNA，待待下下一一实实验验用用作作PCR反应的模板。反应的模板。DNADNA产量测定产量测定 试 剂1、TE：10mmol/L TrisHCl，1mmol/L EDTA2、CTAB（十十六六烷烷基基三三甲甲基基溴溴化化铵铵）/NaCl：将将4.1g NaCl溶溶解解 于于80ml水中，缓慢加入水中，缓慢加入10g CTAB，定容至，定容至100ml。3、苯苯酚酚/氯氯仿仿/异异戊戊醇醇混混合合液液：水水饱饱和和酚酚:氯氯仿仿:异异戊戊醇醇=25:24:1（体积比）。（体积比）。4、氯仿氯仿/异戊醇混合液：异戊醇混合液：氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=24:1（体积比）。（体积比）。5、10g/l RNase A 10%SDS 20 mg/ml 蛋白酶蛋白酶K 5mol/L NaCl 3mol/L NaAc 无水乙醇无水乙醇 75%乙醇乙醇。第三部分 PCR扩增组组 分分 剂剂 量（量（l基因组基因组DNA模板模板10-100ng10Taq Buffer34dNTP（各（各10mol/L）0.5上游引物（上游引物（HEX标记）标记）1下游引物（下游引物（HEX标记）标记）1Taq DNA聚合酶聚合酶(2.5U/l)0.5dH2O（随模板体积变化）（随模板体积变化）总体积总体积30PCR反应程序阶段阶段温度温度时间时间 起始变性起始变性943min 变性变性9430s循环循环30次次 退火退火6030s延伸延伸7245s最后延伸最后延伸7210min 第四部分基因芯片杂交和检测每个阵列的探针排布标记有标记有HEX的核酸的核酸（无无标标记记的的大大肠肠杆杆菌菌HSP70基因扩增产物）基因扩增产物）（无无标标记记的的黄黄单单胞胞菌菌HtpG基因扩增产物）基因扩增产物）50%DMSO器器材材耗耗材材软软件件实验步骤（1）准准备备芯芯片片：去去掉掉杂杂交交围围栏栏上上的的胶胶纸纸，将将杂杂交交围围栏栏放放在在杂杂交交模模具具中中心心的的同同样样形形状状的的凹凹槽槽中中，胶胶面面朝朝上上，注注意意要要使使杂杂交交围围栏栏与与凹凹槽槽契契合合。用用手手捏捏着着芯芯片片上上贴贴有有标标签签纸纸的的一一端端，将将芯芯片片另另一一端端顶顶着着模模具具的的顶顶端端，然然后后将将芯芯片片正正面面（贴贴有有标标签签纸纸）朝朝下下放放入入模模具具。在在芯芯片片背背面面相相应应位位置置用用镊镊子子轻轻轻轻向向下下按按，使使杂杂交交围围栏栏紧紧贴贴在在芯芯片上。片上。撕去围栏上的保护纸贴 围 栏第四部分 实验步骤（2）往往杂杂交交盒盒底底部部凹凹槽槽中中均均匀匀加加入入少少量量蒸蒸馏馏水水（约约200l），以以防防止止杂杂交交过过程程中中杂杂交交液液大大量量挥挥发发。把把芯芯片片有有杂杂交交围围栏栏的的一一面面朝朝上上放放入入杂杂交交盒盒中中，按按芯芯片片摆摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。盖片盖片芯片芯片标签端标签端盖盖片片正正面面观观往杂交盒底部的凹槽中加水将贴好围栏的芯片放入杂交盒注注意意：围围栏栏朝朝上上盖上盖片注意：盖片的凸起面向下注意：盖片的凸起面向下第四部分 实验步骤（3）杂杂交交：将将杂杂交交液液用用移移液液器器混混匀匀后后3000r/min离离心心30s，95热热变变性性3min。冰冰浴浴骤骤冷冷1min。用用移移液液器器将将杂杂交交液液注注入入盖盖片片上上的的小小孔孔。盖盖上上杂杂交交盒盒的的盖盖板板，两两侧侧用用两两个个卡卡子子扣扣上上，确确保保杂杂交交盒盒的的密密封封性性。在在42水浴中杂交水浴中杂交2小时。小时。加杂交液盖上盒盖，插上卡子放入恒温水浴中保温第四部分 实验步骤（4）清清洗洗：洗洗液液先先预预热热至至42。将将芯芯片片转转移移到到盛盛放放洗洗液液的的清清洗洗盒盒中中，杂杂交交面面朝朝上上放放在在水水平平摇摇床床上上清清洗洗。依依次次在在洗洗液液、中中各各清清洗洗4分分钟钟。然然后后放放在在50ml锥锥形形离离心心管管中中（标标签签纸纸端端朝朝下下），1500 r/min离心离心1分钟以除去芯片表面的水分。分钟以除去芯片表面的水分。（5）扫扫描描及及结结果果测测定定：启启动动微微阵阵列列芯芯片片扫扫描描仪仪系系统，进行芯片扫描，保存检测结果。统，进行芯片扫描，保存检测结果。清洗清洗甩干甩干基因芯片扫描仪微阵列芯片扫描仪微阵列芯片扫描仪EcoScanEcoScan100100基因芯片扫描仪工作原理基因芯片扫描仪工作流程软件界面按钮区按钮区状态栏状态栏图象显示区图象显示区控制区控制区大肠杆菌的检测结果黄单胞菌的检测结果试 剂（1 1）20SSC20SSC：在在800ml800ml水水中中溶溶解解175.3g 175.3g NaClNaCl和和88.2g88.2g柠柠檬檬酸酸钠钠，加加入入数数滴滴HClHCl溶溶液液调调pHpH至至7.07.0，加加水水定定容容至至1000ml1000ml，分装后高压灭菌。，分装后高压灭菌。（2 2）杂杂交交液液：6l 6l 100100甲甲酰酰胺胺，0.24l 0.24l 1010SDSSDS，1.8l 1.8l 20SSC20SSC和和4l4l荧光标记的荧光标记的PCRPCR扩增产物。扩增产物。（3 3）洗液）洗液：2SSC2SSC，0.2%SDS 0.2%SDS（4 4）洗液）洗液：0.2SSC 0.2SSC