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1、粪便标本 粪便标本中常见得病原菌: 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其她沙门氏菌 厌氧链球菌种 志贺菌属 结核分枝杆菌 致病大肠埃希氏菌 产气荚膜杆菌 弧菌属菌种 艰辨梭菌 气单胞菌种 白色念珠菌 邻单胞菌 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌 沙门－志贺氏菌:接种HE及麦康凯平板,３5℃、1８～24小时后检查平板,有疑似菌落,接种双糖,细菌分纯后用细菌鉴定仪上板鉴定后与沙门、志贺氏菌因子血清凝集,以确诊。 霍乱弧菌培养:取疑似患者粪便接种于碱性蛋白胨水中,
2、进行增菌,同时划线接种于碱性琼脂平板/双洗平板血琼脂平板,孵育。增菌培养孵育6小时后,取菌膜移种于上述平板,进行分离培养,并同时做涂片,行革兰染色与悬滴标本,检查形态与活动力。各种分离平板在孵育18－24小时。观察菌落,挑取可疑菌落,先与生理盐水混匀,观察有无自凝现象、再用O１群霍乱多价血清作玻片凝集试验。 如发现霍乱病人,立即向当地防疫部门提供及时准确得信息. 致病大肠埃希氏菌培养:引起腹泻得大肠杆菌有四种-—ＥＴＥC、EPＥＣ、ＥＩＥC、EHEC、取液体状、脓血或糊状粪便或肛拭子划线接种于麦康凯或伊红美兰及血琼脂平板上,３5℃孵育18－２４小时,挑选乳糖发酵菌落5个,移种于ＫＩA
3、与MIＵ孵育过夜,并同时进行细菌分纯,用细菌鉴定仪上板鉴定并进行血清学分型. 副溶血弧菌培养:取粪便接种于副溶血弧菌增菌液中,６-8小时后接种于ＴCＢS与SS琼脂平板上,３５℃孵育１8-24小时后,观察菌落,挑取TCBＳ上绿色微隆、浑浊、湿润菌落,ＳS上挑取无色透明、不易挑起菌落进行分纯后用细菌鉴定仪上板鉴定。 真菌培养:真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后,常见于白色念珠菌、球拟酵母菌。将标本接种于含氯霉素得沙保氏琼脂及血琼脂平板,置25－30℃孵育２４—48小时,根据菌落形态及涂片革兰氏染色所见结果,决定鉴定方法. 菌群失调及菌交替症:根据临床提示粪便培养需选
4、用数种培养基,包括强选择性与弱选择性肠道培养基、需氧及厌氧血琼脂平板、沙保氏琼脂等,按各类细菌分别进行培养鉴定,并观察其数量变化、 3、操作流程(沙门-志贺氏菌属检查) 粪便或肛拭子 ↓ ↓ 分离培养 增菌培养 HＥ及麦康凯琼脂分离培养
5、 血平板分离纯培养 血清学鉴定 细菌鉴定 药敏试验 报告 4、报告方式: 以分离目得菌种得结果而决定,如:目前常规以SS/HE与中国蓝或伊红美兰分离粪便中得致病菌,阳性者应报告“沙门菌或志贺氏菌”,阴性应报告“未检出沙门菌属或志贺菌属”。其她培养结果报告方式与上述原则基本相同. 5、注意事项 （1） 人类肠道中得细菌种类繁多,数量亦多,在健康人肠道内经常寄居得大量得细菌,一旦肠道发生病理改变时,就可能侵入病变部位而引起疾病。 （2） 提高阳性检出率必须注意:标本要采集新
6、鲜得、陈旧标本大大影响阳性检出率、 （3） 痢疾患者要采集大量脓血部位进行培养。 (４)切勿粪尿混合否则也会影响阳性检测率、 穿刺液培养常见得病原菌 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌 淋病奈瑟氏菌 A群链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 大肠埃希氏菌 草绿色链球菌 产气肠杆菌 肠球菌 伤寒及其她沙门氏菌 厌氧链球菌 肺炎克雷伯氏菌 结核分枝杆菌 产碱杆菌 产气荚膜芽胞杆菌 铜绿假单胞菌 放线菌 不动杆菌 念珠菌 梭杆菌 拟杆菌 当留取标本时,为防止穿刺液凝固,可在无菌容器内预先加入灭菌肝素,再注入各
7、种穿刺液、 (1) 涂片检查:标本如为浆液,可经３０00r/min离心,取沉淀涂片。如为脓液,可直接涂片,涂片固定后,做革兰氏染色与抗酸染色。 (2) 除常规一般培养外,应根据临床提示得要求增加真菌与结核培养,穿刺液含细胞数量较少,必须做增菌培养。如标本外观非脓样,可加大接种量。平板经35℃2４—48小时孵育后,如有细菌生长,按常规鉴定,无菌生长得平板还应继续孵育至48小时。方可报告阴性、 浆膜腔积液采集 穿刺液(胸水、腹水、关节液、鞘膜液) 涂片革兰氏染色 血平板、麦康凯 巧克力平板 ３5度18－２4h,5％－10%CO２ 初步报告结果
8、 挑取可疑菌落分离培养 菌种鉴定,药敏试验 报告结果 4、报告方式: 穿刺液中检出细菌均应报告鉴定结果及药敏试验、 5. 注意事项 （1） 穿刺液盛于含有抗凝剂得试管或小瓶中,充分混合后,立即送检或置４度冰箱保存。 （2） 应根据临床要求选择相应得培养基。 （1） 对疑有淋病性关节炎患者之关节液,采集应即刻送检或床边培养为佳、 脑脊液标本 正常人体脑脊液就是无菌得。当人体患有脑脊髓膜炎症时,在脑脊髓液中可以出现病原菌、常见得病原菌有细菌、真菌与结核菌等,引起脑脊髓膜炎得微生物主要有: 革兰
9、氏阳性菌 革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈色氏菌 B群链球菌 卡她布兰汉菌 Ａ群链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 肠杆菌科菌种 消化链球菌 脑膜败血性黄杆菌 炭疽芽胞杆菌 假单胞菌 结核分枝杆菌 无色杆菌 产单核细胞李斯特菌 拟杆菌 新型隐球菌、白色念珠菌 腰
10、穿法收取脑脊液3～5ml,盛于无菌试管,应立即送检,否则影响检出率,同时注意保温,不可置冰箱保存,会使病原菌死亡,尤其就是脑膜炎奈色氏菌、肺炎链球菌及流感嗜血杆菌。 实验室接到标本须立即做直接涂片镜检与培养、 (1) 肉眼观察与涂片检查 首先观察脑脊液得外观,除结核性脑膜炎外,其她细菌引起得化脓性脑膜炎多呈明显混浊,经抗生素治疗后,亦可不混浊或轻度混浊。 革兰氏染色:混浊或脓性脑脊液可直接涂片,染色镜检。无色透明得脑脊液,应以3000ｒ/min离心,10－15mｉｎ,取沉淀物涂片,行革兰氏染色,镜检。根据染色反应及细菌形态特征,常可初步提示感染细菌得种类
11、 结核分枝杆菌涂片检查:脑脊液以4000r/min离心30mｉｎ,取沉淀物作小而集中得涂片;亦可将脑脊液在室温下静置数小时或1８-２4h,待形成纤维网后,取此脑脊液倾于新得无划痕得洁净载玻片上,多余得液体任其溢出载玻片,使纤维网自然展开,干燥、固定后用萋纳氏染色。 新型隐球菌涂片检查:脑脊液得离心沉淀物行墨汁负染色,可在黑色背景中,见到菌体周围有透明得荚膜,似一晕轮,有时可见到出芽得酵母菌。新型隐球菌,特别就是荚膜窄者易与白细胞相混淆,可用０.1％甲苯胺兰染色法加以区别、新型隐球菌得菌体呈红色园球状,荚膜不着色,白细胞染成深蓝色。 (2) 培养 A。
12、一般培养应抽2—3ml放如血培养瓶中(同血培养)。主要用于脑膜炎奈色氏菌、链球菌、葡萄球菌、大肠埃希氏菌、产气杆菌、流感嗜血杆菌等细菌得分离、 对有得未直接打入血培养瓶得标本,用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀得沉淀物,分别接种于血琼脂平板及巧克力琼脂平板上,置35℃CO2环境中培养18－2４h,检视有无细菌生长。根据菌落特点及染色后镜检得特征,初步判定细菌得种类,并进一步分离纯培养后配制菌悬液上板条并做细菌鉴定及血清学检查,并作出报告。 血平板与巧克力平板就是分离用得最基本培养基。巧克力平板需放入CO2环境中,有利于检出脑膜炎奈色氏菌、肺炎链球菌及嗜血杆菌等。
13、 结核分枝杆菌培养:取离心后得沉淀物,接种罗-琴氏培养基,斜置于35℃温箱,孵育7天后,直立,继续孵育生长至八周,无菌落生长,发阴性报告;有菌落生长,鉴定后发报告。 真菌培养:取经离心后得沉淀物,接种于科玛嘉显色平板上,放在35℃孵箱中孵育,一般2—3天即可出现菌落。极少数真菌需培养2-3周,才能出现菌落,甚至培养阴性、根据菌落形态、涂片所见与细菌鉴定结果等进行鉴定。 3、操作流程: 脑脊液 混浊液可直接检验清亮液应离心取沉淀 涂片、革兰氏染
14、色、镜检 必要时作抗酸染色或墨汁染色法 血琼脂平板 巧克力平板 35℃18-24ｈ ＣO２环境下35℃18-2４h 观察菌落 涂片检查 细菌鉴定/药敏试验 血清学鉴定
15、 发出报告 4、 报告结果: 无论就是涂片还就是培养,一旦检测到阳性应立即通知临床医师。培养并经鉴定得结果报告“×××菌”,同时报告药敏试验结果。 5、 注意事项 （1） 由于脑脊液奈瑟氏菌离体后容易自溶,流感嗜血杆菌等也易死亡,故不论就是做涂片镜检,还就是进行培养检查必须立即送检。 （2） 标本若混浊,最好进行床边培养。 （3） 做好治疗前采集标本。 （4） 要切实防止皮肤表皮葡萄球菌与其它细菌得污染、。 尿
16、液标本 1、标本得采集 ① 中段尿:女性采样前应先用肥皂水或0。1％高锰酸钾溶液冲洗外阴部及尿道口;男性须翻转包皮冲洗,用0、1%新洁尔灭消毒尿道口.灭菌纱布擦干后收集标本、 ② 导尿管导尿采样可减少污染。对留置导尿者,可用碘酒消毒尿道口处得导尿管壁,用空针细针头斜穿管壁抽吸尿液、或消毒后解开接口,弃去导尿管前段尿被、留无污染得膀胱内尿液数毫升送检、不可从集尿袋得下端管口留取标本。 ③送检标本以晨起第一次尿液为佳。 ④ 室温下尿标本耽搁稍久,可致尿内细菌浓度明显增加而影响病原菌与污染菌得区分。不能立即送检者,可暂存4℃冰箱。 正常人体中,膀胱
17、中得尿液就是无菌得,从膀胱穿刺取出得尿液业应就是无菌得、尿液经尿道排出时,受到尿道中细菌得污染而混有细菌。取经尿道排出得中段尿,细菌数不会超过10^3CFU/ml。患有泌尿系感染时,尿中得菌数高于1０^4－5CFＵ/ml,因而,以此界限作为诊断泌尿系感染得依据、 2、 检验步骤: 留检得标本应立即送检,否则尿中细迅速繁殖,使菌落计数不可靠而影响诊断.实验室 接到标本后,须立即进行涂片与培养、用定量接种环或定量加样器取中段尿10UL,滴注在血平板上,用接种环涂抹,待表面干燥后,35℃培养２４H,计数生长得菌落数,乘以10０,求出每MＬ得菌落数、 (1) 涂片检查:一般细菌细菌涂片
18、以无菌操作作吸取尿5～7mｌ,放入无菌试管内,经３00０r/min离心30分钟后,倾去上清液,取其沉渣,制成涂片,行革兰氏染色,镜检、如发现有革兰氏阴性或阳性细菌,即可做出报告. 淋球菌涂片:尿标本如上处理后另制一 张涂片以革兰染色,镜检.如查到细菌并为革兰氏阴性双球菌,肾形,存在于细胞内或细胞外,经培养证实后方可做出报告。 念珠菌涂片:将尿液离心沉淀后,取沉淀物放于洁净玻片上,覆以盖玻片,略加压力,使成薄片,直接用高倍镜观察、如沉渣太多,可滴加10%氢氧化钠,使之溶解后再做镜检、也可制成薄片,干后经火焰固定,革兰氏染色,油镜检查.发现有卵圆形得芽生孢子与管状得假菌丝
19、且革兰氏染色为阳性,就可报告检出念珠菌。 结核分枝杆菌涂片:尿液经4００0ｒ/ｍｉn离心30分钟,取沉淀作涂片,行萋纳氏染色及潘本 汉氏染色,如两张涂片均查见红色杆菌,可报告为“找到结核分枝杆菌”、如萋纳氏染色片上查见红色杆菌,而潘本汉氏染色未查见红色杆菌,则为耻垢分枝杆菌.也可用金胺O－罗丹明荧光染色法、 (2) 培养:临床多用中段尿做细菌培养,应做菌落计数,培养结果才有诊断意义. 培养基常用血平板,在检查淋球菌时,须使用淋球菌平板,并防入CO2环境中孵育、 许多抗生素就是经肾脏代谢得,所以尿中抗生素浓度较高,细菌得细胞壁结构易受破坏,可形成L－
20、型细菌,常规方法不能检出、对用过抗生素得患者,尿培养有条件时须接种高渗培养基,以免漏检、 3、 操作流程: 尿液 涂片 定量培养 分离培养 淋病奈瑟氏菌培养 离心沉淀 计数菌落 血琼脂平板 麦康凯平板 专用淋球菌平板 涂片、革兰氏染色
21、 ５％～1０％CO2 镜检 ３５℃,1８~2４ｈ 35℃,18～24h 观察菌落 涂片、染色、镜检 鉴定细菌 药敏试验 报告 4、报
22、告方式 １0％得尿路感染患者,可能会在同份尿标本中分离到两种细菌,并且都就是病原菌、若同份标本中检到3种以上不同微生物,一般认为污染。尿标本中革兰氏阴性杆菌菌落计数大于１0＾５CＦU/:菌菌落计数大于１0^4CFU/ｍｌ有诊断意义,报告鉴定结果即药敏试验 5、注意事项 (1)尿液标本得采集除婴儿外,一般均使用导尿法,然而就目前国内外细菌室则多用中段 尿,个别病例也可行膀胱穿刺术,在收集标本时应切实防止污染,及时接种,以免细菌繁殖、 （2） 通常正常尿液本应就是无菌得,由于外生殖道细菌得存在与其它因素得影响,虽经消毒得导尿,也难免绝对无菌,因而在实际工作中必须与定量培养法(菌落计数)
23、同时检查。 伤口、创伤面、脓液采集 脓汁及创伤分泌物中常见得病原菌 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 葡萄球菌 假单胞菌 链球菌 肠杆菌科细菌 消化链球菌 腐败谢瓦纳拉菌 炭疽芽胞杆菌 拟杆菌 破伤风芽胞杆菌 梭杆菌 产气荚膜梭菌 嗜血杆菌 溃疡棒状杆菌 产碱杆菌 结核分枝杆菌 无色杆菌 放线菌、奴卡菌 弧菌属细菌 念珠菌 气单胞菌 (１) 涂片检查:脓汁标本在培养得同时均应做涂片,涂片得结果一方面报告临床提供最初得诊治依据,另一方面可作为分离培养得质量指标、涂片见到得细菌均应分离得到、陈旧性脓液,其中细菌已被消化,涂片观察
24、不到细菌,也不可能分离出细菌、 (２) 培养:血琼脂平板与中国蓝/麦康凯琼脂平板就是基础得分离培养基,对于内源性感染病灶 得分泌物往往就是多种细菌混合存在,且以革兰氏阴性菌为主,这就需要选择培养基并以分区划 线法接种。 当疑有嗜血杆菌与奈瑟氏菌存在,应接种巧克力平板,置ＣO2环境中孵育。 分离放线菌与奴卡菌,置于有氧环境中孵育,时间至少在一周以上,每天观察。 3、操作流程 脓汁、创伤分泌物 涂片、染色镜检
25、 需氧培养 结核菌培养 革兰氏染色 抗酸染色 血琼脂平板、麦康凯平板 罗氏培养基 (巧克力琼脂) 观察菌落涂片镜检 同时分离纯培养 确诊报告 4、 报告结果: 对无菌部位得感染,从分泌物中分离到细菌,一般均有临床意义,按分离鉴定得菌种报告细菌名称及药敏试验结果. 5、注意事项 （1） 对确定常居菌群得
26、细菌就是否为创伤感染得病原菌时,一定要注意该菌就是否占数量上得优势、 （2） 目前临床上区分创伤感染或污染,主要瞧细菌向活组织深部侵入程度及每克组织含菌量就是否达到一定阀值。 痰液标本 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 肺炎链球菌 卡她布兰汗菌 A群链球菌 脑膜炎奈瑟氏菌 金黄色葡萄球菌 流感嗜血杆菌 厌氧球菌 肺炎克雷伯氏菌 结核分枝杆菌 其她肠杆菌科细菌 白喉棒状杆菌 假单胞菌属细菌 防线菌、奴卡菌 嗜肺军团菌 念珠菌 上呼吸道栖居正常菌群:
27、 下呼吸道感染常见病原菌: ａ、r链球菌 棒状杆菌 微球菌 拟杆菌 奈瑟氏菌 梭杆菌 嗜血杆菌 厌氧球菌 表皮葡萄球菌 下呼吸道感染常见病原菌: (1) 痰涂片检查: 目得:为确定标本就是否适合做细菌培养;初步判定就是否有病原菌存在. 一般细菌涂片检查:挑选痰液中脓性或带血部分,涂成薄片,行革兰氏染色,镜检、根据其细菌形态、排列与染色性,大致可以初
28、步推断菌属(或种)。 结核分枝杆菌涂片:以接种环取干酪样或脓性部分得痰制成涂片,作萋纳氏或金胺“Ｏ”荧光染色. 放线菌及奴卡菌涂片检查:将痰液用生理盐水洗涤数次,如含血液,则用蒸馏水溶解红细胞,然后挑取黄色颗粒或不透明得着色斑点,置载玻片上,覆以盖玻片,轻轻挤压,置高倍镜下观察结构、然后揭去盖玻片,干后作革兰氏及萋纳氏染色,镜检、 (2) 培养:下呼吸道得病原菌种类繁多,除一般细菌外,还有结核菌、真菌、厌氧菌等.所以,除基本分离培养外,还须用特殊培养基与适当得培养环境. (3) 对于直接来自下呼吸道得标本,应定量或半定量做细菌计数培养、 3、操作流程
29、 痰液及下呼吸道分泌物 肉眼观察 培养前处理及分离培养 涂片检查 血琼脂平板、麦康凯 巧克力平板 科玛嘉真菌显色平板 罗氏培养基 需氧培养 ＣO2环境 需氧培养 培养八周 3５℃,１8~２４小时 35℃,18～24小时 3５℃,１８～24小时 每周观察 观察菌落与涂片染色镜
30、检 菌种鉴定 药敏试验 确定报告 4、 报告方式 痰中得病原菌不少属于机会致病菌,与正常菌群同在,在报告时应作说明.对于机会致病菌,一般仅当其数量超过正常菌群时才可报告鉴定结果及其敏感试验结果、 检出致病菌时,除报告该菌得鉴定名称外,还需同时报告正常菌群得情况。 通常以报告草绿色链球菌与奈瑟氏菌作为正常菌群存在得指标。报告得各种细菌应该注明各自所占比例情况,以“+”表示.未检出病原菌时,应报告“正常菌群”。 ５、注意事项 （1） 痰标本得收集过程常受到唾液或鼻腔及咽部分泌
31、物得非病原菌所污染,尤以慢性呼吸道感染多见,这直接干扰细菌学检查结果,患者接受某些药物得治疗,使有关菌受到抑制,这样也影响阳性检出率。 一般均收集晨痰,但在咳前必须充分漱口,避免口腔与鼻烟腔分泌物得污染。 血液与骨髓标本 1、标本得采集与处理:一般应在疾病早期,高热期间,抗菌药物治疗前,以无菌手法采血。采血量约为培养液得1/10(静脉血４-5ML,骨髓1-2ML),然后接种双相血培养瓶,充分混匀后送检。 ① 通常采血部位为肘静脉。疑似细菌性心内膜炎时,以肘动脉或股动脉采血为宜。切忌在静滴抗菌药物得静脉处采取血标本、 ② 采血部位得局部皮肤应严格消毒。将采集得血液注入血
32、培养基前,应更换针头或过火消毒针头、血培养瓶应在避光室温中保存,不必置冰箱保贮。 ② 每次采血量成人5一10ml,婴幼儿l一５mｌ,培养基与血液之比以 lO:１为宜,以稀释血液中得抗生素、抗体等杀菌物质。 ④ 怀疑菌血症应尽早采血,体温上升阶段采血可提高阳性率,但要防止因等待而延误时机、对已用抗菌药物而又不能停药者,可在下次用药前采血。 ⑤ 每例至少采血两次,间隔０.5一lh,以利于提高阳性率与区分感染菌与皮肤污染菌。 ⑥ 对疑为细菌性骨髓炎或伤寒病人,在病灶部位或髂前(后)上棘处严格消毒后抽取骨髓lml作增菌培养。 2、检验步骤: 实验室接到送检得血
33、培养瓶后,立即放培养箱。 血培养瓶置35℃培养,每日观察一次。根据肉眼观察有无细菌生长,摇匀培育液并覆盖固相后继续培养。下列情况提示细菌生长:Ａ。固相上有菌落或菌苔生长;Ｂ、均匀混浊;C。血细胞表面出现颗粒状或絮状沉淀物生长;Ｄ。血液发紫;E、液体表面有菌膜、菌环生长。 有菌生长迹象,做如下处理: (1) 取生长物涂片,做革兰氏染色。 (2) 取生长物移种血平板、巧克力等平板,进行分离以获纯。涂片结果证实为一种细菌生长,则可直接一增菌液做鉴定试验.如有二种或多种细菌同时生长,则必须经过分离培养,以获得纯菌后做鉴定、 (3) 无细菌生长迹象得培养瓶,在培养6d 时盲种,培养24小
34、时。未见生长报告为“培养7天无菌生长”。临床诊断为亚急性心内膜炎者,可持续培养至2周再发报告,如可疑布氏菌时可培养28天,可疑军团菌时可培养10天。 (4) 需氧菌培养可转种到血平板或巧克力平板、用血平板可观察到细菌溶血情况,但可能丢失嗜血杆菌、如用巧克力平板,不仅嗜血杆菌可生长,脑膜炎奈瑟氏菌生长也好.转种得巧克力平板需要孵育有CO2得环境. 3、操作流程: 血液、骨髓液 增菌/双相培养(需氧) 涂片
35、染色、镜检 分离培养 手工法直接药敏 35℃ 需氧培养及ＣO2环境培养 ４～6h (血琼脂、巧克力平板等分离) 初步报告 菌落观察 涂片、革兰氏染色、镜检 血平板上纯培养
36、 血清学检查 菌种鉴定/药敏试验 确定报告 4、 报告结果: 为做到快速,可采取以下措施:即每日开始工作时,首先检查血培养,如有细菌生长者,立即处理。 (1) 疑有细菌生长者,经涂片、染色、镜检后,电话通知主管医师。 (2) 此后约6～８小时,应报告药敏试验得初步结果、电话通知主管医师,通报敏感得抗生素 (３)任何时候平板上长出单个菌落,立即完成鉴定及标准化药敏试验,发出报告。 (4) 培养
37、4天仍为阴性得标本,应通知临床医师,以便做相应处理、 (5) 培养7天仍为阴性者,报告无菌生长。 ５、注意事项 (１)许多细菌均可引起菌血症,病原菌、条件致病菌乃至非条件致病菌,均可在机体抵抗力降低,大量应用抗生素得情况下于血中出现、 (2)血液培养得阳性率与抽血时间、治疗与否密切相关,为此应了解细菌出现得规律,力争在治疗前抽血,必要就是进行骨髓培养,或停止用药,以消除药物对细菌得作用及快速培养得目得。 (3)鉴于细菌培养阳性受许多因素影响,甚至有些培养可持续患者死亡后转为阳性,因此对血培养阴性结果除继续反复培养外,不能轻易做出判断,应结合临床资料。 （3） 对于罕见得细菌或
38、暂时鉴定不了得细菌,可进行药敏试验,并将菌种报送上级单位进行鉴定。 菌种鉴定 1、 革兰阴性杆菌鉴定 如果就是革兰阴性杆菌,则需要做氧化酶试验,同时接种一支克氏双糖管,以观察乳糖、葡萄糖、硫化氢反应结果。 结果观察: 氧化酶 双糖管 板条选择 配置浓度 肠杆菌 阴性 K/A 或 Ａ／A GＮ４8 ６1％加T溶液5０ul 非发酵菌* 阳性 Ｋ/K 或 K／- ＧN4８ 52％,不加 T溶液 弧菌科(弧菌属,气单胞菌,邻单胞菌) 阳性 Ｋ/A GN48 ５2％,不加 T溶液 注:*特例:不动杆菌属,嗜麦芽寡养单胞菌,唐菖蒲伯克霍尔德菌等菌得
39、氧化酶阴性,但就是非发酵菌。 １)用空白得IＦ鉴定培养液将比浊仪上得数据调至1００、 2)将相应浓度得标准比浊管插入比浊仪进行比色,读数。 3)如需要加T溶液,将先前调100得培养液中加入50uｌ得T溶液。 4)取一根消毒好得棉签放入培养液中浸湿。 5） 在菌苔上滚动棉签使细菌粘在棉签上,而不要滑动棉签。注意避免将琼脂粘在棉签上。 6） 在试管内壁上旋转棉签,使菌块均匀地被研开。 7） 将棉签从上向下醮入培养液中并搅拌成均质混悬液,盖上盖子,颠倒混匀、 8）
40、校正菌液浓度在要求浓度范围(标准管读数得±２0)、您可以用继续加入菌落或加入培养液得方法调节菌液浓度。请在读数前颠倒混匀。 9） 检验混悬液充分混匀而没有凝块、混悬液无凝块对制备菌液就是很重要得。如果只有很少得凝块,可以让它沉在管底,而只用上面得悬液、 10） 在板条上标记好菌株得名称编号、板条类型GN4８),注意请标记在板条上,而不要标记在盖子上、 11） 请按无菌操作要求将菌悬液加入多通道移液器得加液槽中。 12） 将消毒好得移液器头插在移液器上,请注意插紧。 13） 用移液器吸取菌悬液150ul,注意观察每个移液器头内得液面就是水平得。 14） 将菌液加入鉴定板得孔中,一种细
41、菌加48个孔,(1—6列或7－12列)。注意不要将菌液溅入其她孔中。避免污染物混入,避免用移液器头触及板条底部而将碳源带走 15） 将板条得盖子盖好。 16） 肠杆菌科放３5度培养18—2４小时 非发酵菌、弧菌科放30度培养18－2４小时 单位 临床微生物实验室 菌种鉴定程序 修订次数: 0 修改日期: 采用日期: 文件编码: 第 2 页 共 3 页 17） 板条上仪器读数,打印报告、 注:若分析结果为志贺氏菌属或沙门菌属细菌,必须结合血清学试验结果方可报告临床。 2.革兰阴性苛养菌鉴定 革兰阴性苛养菌包括奈瑟菌属,嗜血杆菌属 特性
42、 氧化酶 板条选择 配置浓度 奈瑟菌属 阳性 GＮ４8 20％+ T溶液 ５0 ul 嗜血杆菌(苛养菌) 阳性 GN４8 20％+ T溶液 5０ uｌ 1)用空白得IF鉴定培养液将比浊仪上得数据调至1０0。 2)将相应浓度得标准比浊管插入比浊仪进行比色,读数。 ３)如需要加T溶液,将先前调10０得培养液中加入５0uｌ得Ｔ溶液。 4)取一根消毒好得棉签放入培养液中浸湿。、在菌苔上滚动棉签使细菌粘在棉签上,而不要滑动棉签。注意避免将琼脂粘在棉签上。 5） 在试管内壁上旋转棉签,使菌块均匀地被研开、 6） 将棉签从上向下醮入培养液中并搅拌成均质混悬液,盖上盖子
43、颠倒混匀、 7） 校正菌液浓度在要求浓度范围(标准管读数得±２０)。您可以用继续加入菌落或加入培养液得方法调节菌液浓度。请在读数前颠倒混匀。 8） 检验混悬液充分混匀而没有凝块。混悬液无凝块对制备菌液就是很重要得。如果只有很少得凝块,可以让它沉在管底,而只用上面得悬液。 9） 在板条上标记好菌株得名称编号、板条类型GN4８),注意请标记在板条上,而不要标记在盖子上。 10） 请按无菌操作要求将菌悬液加入多通道移液器得加液槽中。 11） 将消毒好得移液器头插在移液器上,请注意插紧。 12） 用移液器吸取菌悬液,注意观察每个移液器头内得液面就是水平得、 13） 用移液器吸取菌悬液１
44、５0ul,注意观察每个移液器头内得液面就是水平得。 14） 将菌液加入鉴定板得孔中,一种细菌加48个孔,(１—６列或７－12列)。注意不要将 菌液溅入其她孔中。避免污染物混入,避免用移液器头触及板条底部而将碳源带走 15） 将板条得盖子盖好。 1６) 嗜血杆菌,奈瑟菌 放35度CO2培养箱培养18－２４小时、 1７) 板条上仪器读数,打印报告。 3.革兰阳性球菌/杆菌操作方法 若为革兰阳性球菌,则必须做触酶试验。若触酶试验为阳性,涂片革兰染色为葡萄状排列、则需做凝固酶试验(分玻片法与试管法)。 触酶 板条选择 配置浓度 葡萄球菌,微球菌 阳性 GP4８ 2
45、0% +T溶液5０ul 链球菌 阴性 GP48 20% +T溶液50ul 无芽胞杆菌 GP4８ 20％ +T溶液50ul 芽胞杆菌 ＧP4８ 28％ +T溶液50ｕｌ 1)用空白得IF鉴定培养液将比浊仪上得数据调至10０。 2)将相应浓度得标准比浊管插入比浊仪进行比色,读数、 ３)如需要加T溶液,将先前调100得培养液中加入５0uｌ得T溶液。 4)取一根消毒好得棉签放入培养液中浸湿、 5） 在菌苔上滚动棉签使细菌粘在棉签上,而不要滑动棉签。注意避免将琼脂粘在棉签上。 6） 在试管内壁上旋转棉签,使菌块均匀地被研开。 7） 将棉签从上向下醮入培养液中并搅
46、拌成均质混悬液,盖上盖子,颠倒混匀。 8） 校正菌液浓度在要求浓度范围(标准管读数得±20)。您可以用继续加入菌落或加入培养液得方法调节菌液浓度。请在读数前颠倒混匀。 9） 检验混悬液充分混匀而没有凝块。混悬液无凝块对制备菌液就是很重要得。如果只有很少得凝块,可以让它沉在管底,而只用上面得悬液、 10） 在板条上标记好菌株得名称编号、板条类型(GP48)注意请标记在板条上,而不要标记在盖子上、 11） 请按无菌操作要求将菌悬液加入多通道移液器得加液槽中。 12） 将消毒好得移液器头插在移液器上,请注意插紧、 13） 用移液器吸取菌悬液,注意观察每个移液器头内得液面就是水平得。 1
47、4） 菌液加入鉴定板得孔中,一种细菌加48个孔,(1—6列或7-12列)。注意不要将 菌液溅入其她孔中。避免污染物混入,避免用移液器头触及板条底部而将碳源带走 15） 将板条得盖子盖好 16） 革兰阳性球菌／杆菌放３５度培养１8-２4小时 17） 板条上仪器读数,打印报告。 4、 真菌鉴定 若为真菌,则接种科玛嘉真菌显色平板,35℃,24－４８小时瞧结果、 菌落色彩 初筛念珠菌 绿色、翠绿色(直径约2ｍm) 白色念珠菌 蓝灰色、铁蓝色(直径约１。5ｍｍ)
48、 热带念珠菌 粉红色(模糊、有微毛、菌落较大,直径约4-５ｍm) 克柔念珠菌 紫色(直径约2mm) 光滑念珠菌 白色等 其它念珠菌 氧 化 酶 试 验 阳性反应:在30秒内出现紫红色者、 阴性反应:不出现紫红色、 质控菌株 结果 铜绿假单胞菌 ＡTCC2７８５3 + 大肠埃希菌 ＡＴCC２59２2 — 触 酶 试 验 阳性反应:在１分钟内产生大量气泡。 阴性反应:不产生气泡 质控菌株 结果 金黄色葡萄球菌 ＡT
49、CC２5923／29213 + 粪肠球菌 ＡTCC 2921２ - 药物敏感 肠杆菌板条质控范围 抗生素名称 ２５922 ２７853 ＳＭZ(1/１9～8／１52) ≤0、５/9、5 S 152~608 R 氧氟沙星(0。5~1６) 0、015～0.12 1～8 R 庆大霉素(１~32) ０、25—1 0。５－２ S 阿米卡星(４～128) 0、5-4 １-4 环丙沙星(0。25～8) ０。0０４-0、０16 0.25—1 S 亚胺培南(1~32) 0、０6-０.25 1－4 S 哌拉西林(８～256)
50、 1—4 1－8 Ｓ 氨苄西林(2～64) ２－8 S - 氨苄西林/舒巴坦(2～６4) 2-8 Ｓ － 头孢唑啉(2～64) 1—4 S － 头孢呋新(2～６4) 2－8 S - 头孢克洛(2～64) 1-４ S — 头孢吡肟(２~６４) 0、016—0。12 １—８ Ｓ 头孢她啶(4～１２8) 0。06—0.5 １－4 S 头孢噻肟(４~12８) 0、03-０.１2 8—32 I 头孢曲松(4～12８) 0、03－0、１2 8-64 I 葡萄球菌板条质控范围 抗生素名称 2９21３ 2９２１2 环丙沙星
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