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丙型肝炎的疫苗研究现状
摘要：　丙型肝炎病毒〔hepatitis C virus, HCV〕是引起输血相关肝炎及慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原，目前尚无有效的治疗与预防手段。本文综述了当前世界HCV疫苗研究的进展，并分析了疫苗研制中存在的问题和疫苗研制的策略。
关键词：丙型肝炎病毒；丙型肝炎；疫苗
Current advances in hepatitis C virus(HCV) vaccine

Abstract: Hepatitis C virus(HCV) accounts for the majority of transfusion acquired hepatitis and may cause chronic hepatitis, cirrhosis and heaptocellular carcinoma. Currently, there is no effective vaccine against HCV and treatment is expensive and not always effective. In this article, the advances of studies on HCV vaccine were discussed in details. Problems existing in the present and research strategies used in the future were also analyzed.
Key words: hepatitis C virus(HCV); hepatitis C; vaccine
丙型肝炎病毒〔HCV〕是慢性肝病的主要病原之一，呈世界流行，感染率为1-3％，目前全球约有1.7亿HCV感染患者。约60％的急性丙型肝炎〔HC〕患者转化为慢性，而慢性患者中分别有8-46％和11-19％开展成肝硬化和肝细胞癌[1]。当前对慢性丙型肝炎患者除干扰素外没有更特异的有确定疗效的治疗方法，因此，HCV感染的防治工作更应以预防为主，开展切实有效的丙型肝炎疫苗是当务之急。本文综述了当前世界HCV疫苗研究的进展，并分析了疫苗研制中存在的问题和疫苗研制的策略。
1　HCV基因结构与疫苗研制中的问题
HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组全长9.6 kb，其5′端有一个319-341 nt结构较为保守的非翻译区〔untranslated region, 5′-NTR〕。后面为一个连续的开放阅读框架〔open reading frame, 0RF〕，可编码一个多聚蛋白前体，此多聚蛋白前体由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋El〔Core、E1、E2〕和7个非结构蛋白〔P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B〕。HCV C蛋白由191个氨基酸残基组成，是HCV基因组中较为保守的结构区域。5′UTR区最为保守，而3′UTR对于HCV RNA的正常复制是不可缺少的〔图1〕[1]。

图1　HCV基因结构
由于HCV基因序列存在高度变异性，丙肝疫苗的研制面临很多的挑战：①HCV RNA和病毒蛋白变异性很大，有6种基因型及50多种基因亚型，因而，研制一种可望全球通用的丙肝疫苗十分困难。②HCV准种的存在，是丙肝疫苗研制的又一障碍，即感染人体的HCV为一群不同的HCV株，且在体内极易发生突变，尤其是在HVR1区，这就使变异的HCV株可能逃避疫苗已建立的保护性免疫监视，这些准种的性质及复杂性也影响预防和治疗的成功率。深入的系统进化分析可将HCV分成至少6个主要的基因型和至少70个不同的亚型。其中基因型1、2、3型在我国分布最广。大多数HCV感染者都有抗HCV核心蛋白、NS3和NS4的抗体，但是这些抗体的中和作用不明显，并且感染了HCV后抗-HCV阳性的黑猩猩受到同源或异源HCV株攻击后，仍可再次发病。临床也发现丙型肝炎可以屡次复发。③缺乏易获的适宜的HCV培养系统及HCV感染动物模型。目前，黑猩猩是HCV感染的唯一动物实验模型，但黑猩猩价格昂贵，数目少，且属频危动物。另外，黑猩猩感染HCV后其转归也不完全与人类相同。研究发现，自然感染HCV后痊愈的黑猩猩仍能再次感染同型HCV，提示HCV的自然感染仍不能诱导保护性免疫。④HCV致病的免疫学机制尚未完全澄清，保护性表位亦未得到确认，以上这些都严重限制了HCV疫苗的研发[2]。
2　蛋白疫苗
2.1 肽疫苗 抗原之所以能诱导特异的体液及细胞免疫反响，是由于它在机体细胞中被分解为多肽后与MHC-Ⅱ类或MHC I 类分子结合，以复合物的形式激活了Th细胞，诱生了特异性抗体及CTL[3]。HCV中的某些T细胞表位对病毒的去除十分重要，假设能得到这些多肽，使其在体内或体外直接与MHC I类或MHC-Ⅱ类分子结合，那么所得到的复合物将能有效地刺激机体产生保护性免疫应答而防止了抗原递呈的步骤。基于上述假设，人们构建了一系列HCV的疫苗多肽，或使之与MHC分子结合成复合物，并从中筛选出了一些对研制HCV疫苗具有重要意义的HCV抗原多肽。现今绝大局部工作都在确定具有免疫原性的肽而不是测试最有希望的肽疫苗。在肽疫苗研究中，一个经典的方法是用HCV感染患者的血清来筛选噬菌体表达的肽文库，然后选择出与患者血清特异反响的肽段。用HCV感染的患者血清来筛选在噬菌体文库中表达的数目巨大的HVR 1的所有肽段，可以选择出既有抗原性又有免疫原性的肽段作为那些HVR 1发生变异的数目巨大的变异体的类似物。
2.2 包膜蛋白疫苗 HCV包膜El／E2糖蛋白是HCV的外表蛋白，因而最先被用作诱导中和抗体的候选疫苗靶抗原。黑猩猩试验发现，只有哺乳动物细胞重组表达的E2蛋白或者El／E2异二聚体蛋白免疫能抵抗同株HCV攻击，而用昆虫细胞、酵母和大肠杆菌表达的E2蛋白不起保护作用。由于HCV高度变异的特点，这种方法显然还缺乏以诱导广泛保护性的中和抗体。然而选择适宜的免疫佐剂，对慢性HCV感染者接种重组El／E2蛋白也许可通过增强感染者的细胞免疫应答而促进病毒去除。Leroux-Roels等[4]用HCV H 77株E2区合成肽免疫兔，产生了抗同源性合成肽的高活性抗体。将抗体与等体积含有64个CID 50的H 77株中和后再分别注射2只黑猩猩。研究说明，H 77株至少有19种不同来源病毒株同时存在，E2中的HVR 1具有关键的抗体中和表位从该区产生的合成肽能激发中和抗体产生并能保护黑猩猩对同源性HCV的攻击，但对HCV基因有变异的突变体没有中和作用。一些研究显示，E2中抗HVR 1与中和HCV感染有关，有人从急性肝炎患者别离的H 77株，用其HVR1区合成的21个多肽免疫家兔，用ELISA法证实该免疫血清能防止H 77株感染HPB Ma细胞，但不能阻断对H 77株的突变株H 90株的感染，该结果说明，抗HVR 1抗体的中和作用具有高度特异性。Sällberg等[5]用多种E1和E2重组蛋白与人T细胞淋巴瘤细胞孵育，结果只有哺乳细胞表达的E2重组蛋白能与人T细胞淋巴瘤细胞结合，并发现E2免疫的兔血清能中和E2对靶细胞的结合作用此种抗体叫作中和结合抗体，对HCV感染有一定的防护作用。
尽管HCV的蛋白类疫苗目前取得了一些进展，但是还是处于一个早期阶段。许多策略也证实对小鼠能诱导出强烈的长时间的T细胞介导的免疫反响，对灵长类也取得了一些进展。但由于HCV具有多个基因型及血清型，膜蛋白区同源性小，加之基因突变率高，容易形成没有逃逸病毒株，缺乏具有交叉免疫保护效应的中和抗体，这些诸多因素给HCV蛋白类疫苗研究带来了极大困难。
3 核酸疫苗
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA 或RNA ) 直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以到达预防和治疗疾病的目的。由于HCV结构的变异，与传统蛋白质疫苗相比，DNA疫苗明显优于传统疫苗。DNA疫苗克服了传统病毒减毒疫苗、灭活疫苗或多肽疫苗所造成的抗原决定簇的改变，保持了完整的免疫原性；DNA疫苗既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫，而以后者为主要特征；DNA疫苗可在体内长期、稳定表达外源蛋白，这为研制和开发利用多基因型与基因突变率高的病毒性疾病疫苗提供了理论依据。主要有C区DNA疫苗、E区DNA疫苗、C+E区DNA疫苗、Ns区DNA疫苗等。
Zhu等[6]研究了以HCV E1、E2基困构建的重组质粒免疫BALB／c小鼠的免疫效果。结果说明：3次免疫后，所有小鼠均出现了抗El、E2抗体，抗E1抗体滴度最高达l：320，而抗F2抗体滴度最高达1：1280。淋巴细胞增殖实验未见有针对E1的特异性增殖，而针对E2的增殖刺激指数平均为1.4，且免疫后的小鼠IFN-1的分泌也显著高于对照组。Lagging等[7]构建了C基因〔第1-191aa〕重组质粒pcDNA HCV Core，0.2 mg质粒肌肉注射免疫BALB／c小鼠2-3次后，于第6 wk处死小鼠，可检测到较高水平的抗C抗体，免疫2次或3次的抗体滴度相似。这些结果提示HCV C区将有助于HCV疫苗的研制。以上实验说明，HCV C区构建的重组质粒均能在真核细胞中表达，且能诱导出特异性体液免疫和细胞免疫，加上C区相对保守，是研制HCV DNA疫苗的主要靶抗原之一。Rollier等[8]以HCV Ia基因型E2区不同基因片段构建了3种不同重组体，用im或im加iE等不同途径免疫小鼠，抗体阳性率在60-100％之间。可见HCV DNA免疫，im加iE是最有效的方法。Ara等[9]将编码结构区〔C+E1+E2〕基因片段〔341-2449nt〕克隆入含CMV启动子的PRC载体中，构建HCV结构区DNA疫苗，通过哺乳细胞体外表达和免疫小鼠研究证实，其不仅能在Human293、BALB／c、cosl中表达C、E1、E2蛋白，而且还能诱导BALB／c小鼠产生抗体和特异性CTL的活性。另有人用HCV C+E2序列构建的质粒DNA疫苗免疫小鼠能诱导特异性的CTL活性、抗C和抗E2抗体应答，和Thl为主的增生有关。Lang等 [10]一证实在HCV NS3区存在一个CTL表位，其最小单位由10肽组成，推测其可作为HCV DNA疫苗构建的有效。
与传统的蛋白质疫苗相比，DNA疫苗有可激发机体全面的免疫应答、可表达接近天然构象的抗原，抗原性强以及能联合免疫等优点。但同时，DNA疫苗仍有许多实际问题阻碍其开展。主要表达在：〔1〕HCV属RNA病毒，具有高度的变异性；〔2〕只对人及黑猩猩易感；〔3〕难以体外培养；〔4〕缺乏有效的体外复制系统等问题，仍需进一步研究。
结语
综上所述，对HCV疫苗的研究尚存在许多困难，但随着对HCV免疫机制的进一步了解，通过对体外复制模型的进一步完善及增强免疫效果的研究，相信在不远的将来，HCV疫苗的研制一定会有突破。
参考文献
1. Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. Cyclosporine A inhibits hepatitis C virus nonstructural protein through cyclophilin A. Hepatology. 2022, 50(5): 1638- 1645.
2. Martínez-Donato G, Musacchio A, Alvarez-Lajonchere L, et al. Ratio of HCV structural antigens in protein-based vaccine formulations is critical for functional immune response induction. Biotechnol Appl Biochem. 2022, 56(3): 111-118.
3. Buonaguro L, Petrizzo A, Tornesello M, et al. Immune signatures in human PBMCs of idiotypic vaccine for HCV-related lymphoproliferative disorders. J Transl Med. 2022, 19(10): 8-18.
4. Leroux-Roels G, Depla E, Hulstaert F, et al. A candidate vaccine based on the hepatitis C E1 protein: tolerability and immuneogenicity in healthy volunteers. Vaccine, 2004, 22(11): 3080- 3086.
5. Sällberg M, Frelin L, Weiland O. DNA vaccine therapy for chronic hepatitis C virus (HCV) infection: immune control of a moving target. Expert Opin Biol Ther. 2022, 9(7): 805- 815.
6. Zhu Q, Guo JT, Seeger C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J virol, 2003, 77(12): 9204- 9210.
7. Lagging LM, Meyer K, Hoft D, et al. Immune responses to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein. J virol, 2005, 69(9): 5859- 5863.
8. Rollier C, Depla E, Drexhage JA, et al. Control of heterolozous hepatitis C virus infection in chimpanzees is associated with the quality of vaccine induced peripheral T-helper immune response. J virol, 2004, 78(6): 187-196.
9. Ara Y, Saito T, Takagi, et al. Zymusan enhances the immune mspouse to DNA vaccine for human immunodeficiency virus type-1 through the activation of complement system. Immunology, 2001, 103(1): 98- 105.
10. Lang KA, Yan J, Draghia-Akli R, et al. Strong HCV NS3- and NS4A-specific cellular immune responses induced in mice and Rhesus macaques by a novel HCV genotype 1a/1b consensus DNA vaccine. Vaccine. 2022, 26(49): 6225- 6231.
11. 内容总结

12. 〔1〕丙型肝炎的疫苗研究现状
摘要：　丙型肝炎病毒〔hepatitis C virus, HCV〕是引起输血相关肝炎及慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原，目前尚无有效的治疗与预防手段
〔2〕主要有C区DNA疫苗、E区DNA疫苗、C+E区DNA疫苗、Ns区DNA疫苗等

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