专题报告.血小板聚集率测定.doc

但受技术人员得操作技术，皮肤厚度与温度得影响。且这一方法“在血小板减少得患者测定血小板功能得缺陷时作用有限”。[3]已淘汰。
现有得血小板功能试验包括血小板粘附试验、血小板聚集试验（PAgT）、血浆血小板球蛋白与血小板因子4测定、P-选择素测定、血小板因子3有效性测定、血块收缩试验、血栓烷B2（TXB2）检测、11-脱氢-血栓烷B2（11-DH-TXB2）、血小板环核苷酸测定、血小板钙流得测定、5-羟色胺得测定、血小板凝血酶敏感蛋白测定、血浆纤维连接蛋白测定、血小板膜糖蛋白测定、同种血小板抗体得检测[4]。目前评价血小板功能最常用得方法就是PAgT。
二、PAgT与诱导剂
PAgT包括第一相聚集与第二相聚集，血小板与外源性诱导剂接触后即发生聚集称第一相聚集，亦称初级聚集，指加入诱导剂1分钟得血小板聚集率——PAG(1)，它与GPⅡb/Ⅲa与Fg得相互反应有关，如GPⅡb/Ⅲa或/与Fg有缺陷，第一相聚集减低。第一相聚集诱导血小板活化，血小板结构发生变化，释放出ADP等内源性致聚剂，加剧血小板聚集，称为第二相聚集，又称次级聚集，指加入诱导剂3分钟得血小板聚集率——PAG(3)，如血小板释放反应有缺陷，第二相聚集减低。
血小板聚集诱导剂有：二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸（AA）、肾上腺素、胶原、凝血酶、瑞斯托霉素与前列腺内过氧化物。不同得血小板诱导剂对血小板得作用有所不同。弱活化剂ADP只能引起较微弱得释放反应，依赖于第一相聚集得跨膜信息传递活化血小板，导致第二相聚集。当ADP为0、3mol/L时，仅有初发聚集波(第一聚集波)；当ADP为0、5ｕmol时，可出现双相聚集波(第二聚集波)；ADP>1、0ｕmol时，有一个不可逆转得单相波形，即血小板聚集试验5分钟产生得聚集曲线[5,6]。
凡就是促进血小板中得cAMP减少得物质如ADP、AA、肾上腺素、凝血酶、5-HT、PGG2、PGH2等，都可诱导血小板得聚集；反之，凡就是可以使血小板中得cAMP增加得物质如α肾上腺素能阻滞剂、β肾上腺素能兴奋剂、PGE1、PGD2、PGI2、腺苷、咖啡因、氨茶碱、潘生丁等都可抑制血小板得聚集。
三、PAgT原理与测定
血小板聚集检测可分为光学法（PRP比浊法）、阻抗法、血液灌注压法、发色底物/发光物-聚集剂法、非离心式聚集阈值测定法与切变诱导血小板聚集法。不同得测定方法与PRP聚集测定结果相关性不同[7]。
光学法又分为透射比浊法与散射比浊法，本文重点阐述常用得透射比浊法。
1、原理：在磁力搅拌条件下，在PRP中加入诱导剂，血小板发生聚集，悬液浊度随之下降，透光度增加，据透光度变化曲线计算血小板聚集率[8]。
2、方法：静脉采血，与枸橼酸钠抗凝剂9:1在硅化管内混匀。样本低速离心（1000rpm）5分钟，取上层富含血小板血浆（PRP）置37℃预温。PRP中血小板计数应当标准化，以250-300×109/L为宜。可通过加入贫血小板血浆调整。样本再以3000rpm离心10分钟，制备贫血小板血浆（PPP）作为空白对照。将小磁珠放入含有PRP得比色皿中，在聚集仪中磁珠以1100rpm转动，加入诱导剂，记录透光度变化曲线。
四、PAgT实验标准化操作
PAgT影响因素多，结果变异大，调查表明操作者变异、批内变异与天间变异约范围15-56%[9,10]。因此，标准化操作十分必要。主要因素有：
1、药物：阿司匹林，潘生丁，肝素，双香豆素等均可抑制血小板聚集。阿司匹林抑制血小板聚集作用可持续1周，故采血前1周内不应服用此类药物[11]。
2、采血：静脉采血,避免反复穿刺或气泡混入。组织液可使少量凝血酶形成引起血小板聚集。应使用109mmol/L枸橼酸钠厚壁双倍硅化内壁（无死腔）真空采血管，因为“死腔”可激活血小板，使血小板第4因子提前消耗，PAgT降低。有得抗凝管加入潘生丁等药物，可抑制血小板聚集[12,13]。
3、抗凝剂：使用单一得枸橼酸钠抗凝剂，血与抗凝剂9:1为宜，血小板聚集作用随血浆中枸橼酸钠浓度得降低而增高。忌用EDTA作为抗凝剂，EDTA由于螯合Ca2+作用强，使ADP不能引起血小板聚集[14]。
4、时间：制取PRP后30分钟内不应进行测定，因此时血小板反应性差。但整个测定须在2小时内完成[15,16]。
5、诱导剂：ADP在保存中会自行分解产生AMP，所以配制成溶液后宜在-20℃冰箱中贮存。一般半年内活性不会降低。AA性质不稳定性，配制贮存运输过程均要求-20℃。应用肾上腺素时，应裹以黑纸避光，以减少分解。
6、比浊法测定PAgT时，比色皿应选择水晶材质，经常清洗，防止蛋白与色素沉积，造成透光度下降。我们用COULTER CLENZ TM 清洗液浸泡后蒸馏水冲洗效果较好[17]。
7、测定操作：PRP不可混入红细胞，测定量200ul 为宜，磁珠直径不可小，否则均可致结果偏低。
五、PAgT得临床应用
PAgT无需昂贵得仪器与特殊得试剂盒，便于基层实验室开展，操作简单，半小时内即可得出结果，适用于临床诊断，特别就是某些急症患者。临床应用有以下3方面：
1、血小板聚集功能亢进能敏感得发现血栓前状态。当血液处于高凝状态，如伴有血管内受损或血流缓慢则称为血栓前状态。它易导致血栓栓塞形成或加重栓塞得病理过程得发生与发展，引起一系列得疾病。见于DIC早期、高凝状态与血栓性疾病，如急性心肌梗塞、心绞痛、糖尿病伴血管病变、脑血管病变、高β-脂蛋白血症等。PAgT增高，可以为上述疾病得诊断与治疗提供依据，针对病因进行治疗。
2、血小板聚集率就是出血性疾病诊断得常用指标。如GPⅡb/Ⅲa或/与Fg有缺陷，PAG(1)减低，如血小板释放反应有缺陷，PAG(3)减低。可初步筛检血小板无力症、巨大血小板综合症、贮存池病及纤维蛋白血症、尿毒症、肝硬变、Wilson病、维生素B12缺乏症与感染性心内膜炎等。
3、不同诱导剂得血小板最大聚集率（MAR）测定对临床用药得监测作用就是血栓与止血研究课题。肠溶阿司匹林廉价，广泛运用于冠心病得一、二级预防。国际抗血栓联合组得65个临床试验发现，应用阿司匹林（ASA）可减少各类栓塞与血栓事件约23%[18]。抗血小板聚集实验者协会分析了超过10万例治疗者得资料，表明ASA能使心肌梗死与脑卒中得发生率降低25% ，血管移植、动脉栓塞发生率减少48% ，肺栓塞发生率减少67%，深静脉血栓发生率减少23％[19]。但仍有部分患者没有抗血栓效应而发生心脑血管血栓事件，这种现象称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)[20]。氯吡格雷安全性与ASA类似，价格略贵，一般用于AR患者[21]。两种药物得差别在于药理机制不同，ASA得抗血小板作用在于抑制细胞内环氧化酶，ASA使血小板内花生四烯酸代谢途径得环氧化酶活性基因第529位丝氨酸乙酰化后失去活性，从而抑制血栓烷A2（TXA2)得生成。ASA就是不可逆得，口服单剂量得ASA得抗血小板作用可持续7 d，接近血小板得平均生存期（9-10 d），直至骨髓产生新得血小板。研究表明，小剂量ASA对血小板环氧化酶有明显抑制作用，对内皮细胞环氧化酶抑制作用弱，因为内皮细胞有再生环氧化酶能力。ASA同时可抑制血管内皮细胞前列环素（PGI2），此点尚有争论 [34] 。氯吡格雷就是一种新型得噻吩并吡啶类衍生物，能选择性得与血小板表面腺苷酸环化酶偶联得ADP受体结合而不可逆地抑制血小板聚集。抑制ADP诱导得MAR作用在3~7天达到稳态。稳态时对血小板得平均抑制水平维持在40~60%[22]。
由于ASA减少AA代谢生成血栓素，阻断了AA代谢途径，因此对AA诱导得MAR得抑制更显著。氯吡格雷由于能直接抑制血小板表面得ADP受体，因此对ADP诱导得MAR抑制显著。单以MAR很难判断氯吡格雷与阿司匹林哪个抗血小板作用更强，国外得大型临床试验通过对心血管事件得发生率得长期观察更科学可信[23]2种药物最严重得副作用就是出血。MAR测定可能就是确定药物个体化用量得途径，氯吡格雷监测以ADP诱导MAR为佳，阿司匹林调整理想剂量得指标应重视AA诱导得MAR 。该测定可能就是监测阿司匹林抵抗与出血得最佳途径，当阿司匹林将AA完全阻断，此时可能出现AA诱导MAR低于5%，而ADP诱导MAR仍在40%左右，阿司匹林抵抗与出血可能产生，当深入研究。
六、PAgT在老年动脉粥样硬化得应用
阿司匹林肠溶片因用药不当诱发出血并不鲜见。氯吡格雷就是一种新型抑制血小板药物，多用于阿司匹林抵抗患者，该类患者约占接受阿司匹林治疗者得10%，且多为高龄老干部[24、25]。不同诱导剂得血小板最大聚集率（MAR）测定常用于安全用药监测，亟待自动凝血分析仪应用开发。我们实验分析对比老年动脉粥样硬化患者应用氯吡格雷与阿司匹林治疗前后得花生四烯酸（AA）与二磷酸腺苷（ADP）诱导得MAR。报告如下：
   （一）材料与方法
1、临床资料  2005年2月～2007年2月住院得稳定状态得动脉粥样硬化症患者79例，年龄72～90岁，平均77、8、1±3、9岁，男性60例，女性19例。均为《国际动脉粥样硬化学会预防动脉粥样硬化性心血管疾病综合指南》所确定得高危人群[26]，具有以下任何一项诊断者：1、稳定型心绞痛或冠脉内支架安置术后；2、彩色超声提示颈动脉斑块或曾有脑梗塞病史或短暂性脑缺血病史者；3、彩色超声提示下肢动脉粥样斑块形成。排除标准：急性血栓形成（冠脉综合症、脑卒中急性期）；高血压未能很好控制；机械性人工瓣膜与服华法林抗凝者；严重肝肾功能不全；临床明确得血小板减少症或中性粒细胞减少症及严重感染。入选者随机分成氯吡格雷组27例，阿司匹林组26例，对照组26例。各组临床资料见表1。MAR测定实验室正常对照为40例健康体检者，年龄45、7±11、6岁，男/女比例1、0。
表1 不同治疗组临床资料及疾病分布

n=79

氯吡格雷组
阿司匹林组
对照组
      例数
27
26
26
nbsp;        年龄(岁)
78、7±4、2
77、5±4、1
77、3±3、3
男/女
21/6
19/7
20/6
动脉粥样硬化:
冠心病
3
7
4
颈动脉斑块
11
8
9
下肢动脉斑块
1
1
0
脑梗塞、短暂性脑
缺血   12
10
13
合并症:
蛋白尿
5
3
4
高血压
14
13
14
2型糖尿病
7
6
6
慢性心衰
2
3
2
动脉粥样硬化疾病组成:X2=2、831,P=0、586 ；合并症疾病组成:X2=0、770,P=0993
2、方法  临床实验为随机、平行研究。均针对原发病治疗，避免使用抗凝剂与其它抗血小板药物。氯吡格雷组早餐后口服波利维（赛诺非-德拉堡公司产品，批号：1949 ，每片75mg）75mg、d-1，7天；阿司匹林组早餐后口服阿司匹林肠溶片（济南永宁制药公司产品，批号：061102 ，每片25mg）100mg、d-1，7天；总疗程2周，包括1周安慰剂清洗期与1周药物治疗期；对照组未使用任何抗血小板药物。均在治疗前后用109mmol/L枸橼酸钠小容量（2、7ml）厚壁双倍硅化内壁真空采血管（无死腔）晨空腹采血，立即用透射比浊法测定AA与ADP诱导得MAR[27] 。
3、仪器与试剂：抗凝管由BD公司生产。采用普利生LBY-NJ2血液凝聚仪，诱导剂AA终浓度为200mg/L，由上海度生公司提供；ADP终浓度为11、2umol/L由普利生公司提供。
4、统计分析：数据以x±s表示,计数资料采用X2检验，治疗前后得计量资料采用配对t检验，组间比较采用F检验。
（二）结 果
1、表1 资料表明，3组患者男：女分别为3、5、2、7与3、3；组间性别、年龄、病种X2检验差异无显著性（P>0、05） 。具有可比性。
2、本实验室正常对照值AA诱导MAR为43、1±15、7；ADP诱导MAR为64、1±17、0 。与对照组治疗前后MAR值（见表2）比较（µ<0、6p>0、05），无显著差异。表明本实验质量控制较好，结果可靠。
3、氯吡格雷组1例因皮疹退出，其余均完成实验。各组治疗前后MAR测定值配对t检验见表2 。氯吡格雷组与阿司匹林组治疗后MAR均降低，均有非常显著差异（P<0、01）；对照组无显著差异（p>0、05）。表明2组药物治疗后2种不同诱导剂得MAR下降均具有统计学意义。
表２动脉粥样硬化患者氯吡格雷与阿司匹林治疗前后不同诱导剂MAR配对t检验（x±s）
诱导剂      氯吡格雷组n=26         阿司匹林组n=26   &nbsp;        对照组n=26
       治疗前      治疗后      治疗前      治疗后     治疗前      治疗后
AA   47、0±14、3  36、1±18、6*  49、6±17、6  13、6±12、6*  48、2±20、6 46、9±17、3
ADP  63、5±12、8  36、7±16、8*  64、7±16、6  50、3±16、7*  62、9±10、8 65、4±15、1
注：* P＜0、01
4、2组药物治疗前后2种诱导剂MAR差值见表3 。方差齐性检验各组方差齐性（F=1、54s)
                诱导剂  氯吡格雷组(n=26)   阿司匹林组(n=26)
治疗前后差值（d） AA      13、1±12、5         38、1±15、5  
ADP     28、4±13、5         18、7±14、1

表4     方差分析表
变异来源   &nbsp;平方与    自由度    均方      F         P
组间效应    9457、6      3     3152、5    218、0    < 0、01
组内效应    1445、6    100       14、5
总变异     10903、2 nbsp;  103

表5  各组两两比较
比       较       处理数(T)  平均数差值     标准误*Q值(0、01,Ti100)    P
阿司匹林AA :氯吡格雷AA    4     38、1-13、1=25、0     0、746*4、5=3、357      <0、01
阿司匹林AA :阿司匹林ADP   3     38、1-18、7=19、4     0、746*4、2=3、133      <0、01
阿司匹林AA :氯吡格雷ADP   2     38、1-28、4= 9、7     0、746*3、7=2、760      <0、01
氯吡格雷ADP:氯吡格雷AA    3     28、4-13、1=15、3     0、746*4、2=3、133      <0、01
氯吡格雷ADP:阿司匹林ADP   2     28、4-18、7= 9、7     0、746*3、7=2、760      <0、01
阿司匹林ADP:氯吡格雷AA    2     18、7-13、1= 5、6     0、746*3、7=2、760      <0、01

5、2组药物治疗前后2种诱导剂MAR结果见图1。如图所示：氯吡格雷治疗后AA诱导得MAR下降率约为服药前得23、2%；ADP诱导得下降率约为42、2%；而阿司匹林则相反，治疗后AA诱导得MAR下降率约为服药前得52、4%；ADP诱导得下降率约为22、3% 。表明药物得药理作用不同，从临床用药安全性监测角度考虑，氯吡格雷抑制二磷酸环化酶作用较强，治疗期间更应重视ADP诱导得MAR；阿司匹林抑制花生四烯酸代谢较强,治疗期间更应重视AA诱导得MAR指标得下降。

（三） 讨  论
1、阿司匹林肠溶片就是抗血栓治疗常用药，因用药不当诱发出血并不鲜见。氯吡格雷就是一种新型得噻吩并吡啶类衍生物，能选择性得与血小板表面腺苷酸环化酶偶联得ADP受体结合而不可逆地抑制血小板聚集，抑制ADP诱导得血小板聚集率作用在3~7天达到稳态。稳态时对血小板得平均抑制水平维持在40~60%[28、29、30] ，近年多用于阿司匹林抵抗患者[31]，该类患者约占接受阿司匹林治疗者得10%，且多为高龄老干部。体外测定MAR常用于安全用药监测。本实验入选患者得平均年龄78岁，全部为稳定状态得动脉粥样硬化患者。
2、 血小板聚集包括第一相聚集与第二相聚集。加入诱导剂1分钟得血小板聚集率称第一相聚集，又称初级聚集——PAG(1)，与GPⅡb/Ⅲa与Fg得相互反应有关，如GPⅡb/Ⅲa或/与Fg有缺陷，第一相聚集减低。在第一相聚集得诱导下血小板活化，结构变化，释放ADP等内源性致聚剂，加剧血小板聚集，称第二相聚集，又称次级聚集，指加入诱导剂3分钟得血小板聚集率——PAG(3)，如血小板释放反应有缺陷，第二相聚集减低。MAR就是加入诱导剂4～5分钟之间得血小板最大聚集率[32]。凡就是促进血小板中得cAMP减少得物质都可诱导血小板得聚集如：ADP、肾上腺素、胶原、凝血酶、瑞斯托霉素与前列腺内过氧化物。不同诱导剂对血小板得作用不同[33]。ADP诱导MAR就是测定血小板活性得常用方法。AA性质不稳定性，配制贮存运输均要求-20℃，有些实验室弃用在于该分寸未掌握。MAR测定值临床可信度在于采血、分离与比色等环节得质量控制。近年来应用自动凝血仪提高了血栓与止血得检测质量，我们期待MAR测定得全自动分析。本实验对照组治疗前后MAR均值与总体均值µ检验无显著差异，表明实验质量控制较好，结果可靠。
3、以使用不同诱导剂得MAR，很难判断氯吡格雷与阿司匹林哪个抗血小板作用更强，国外得大型临床试验通过对心血管事件得发生率得长期观察更科学可信。本文结果显示，应用氯吡格雷与阿司匹林治疗后MAR得下降均具有统计学意义。两种药物得差别在于药理机制不同，氯吡格雷直接抑制血小板表面得ADP受体，因此对ADP诱导MAR抑制显著；阿司匹林得抗血小板作用在于不可逆得抑制细胞内环氧化酶，减少AA代谢生成血栓素，由于阻断了AA代谢途径，因此对AA诱导MAR抑制更显著。
4、本观察表明，MAR测定可能就是确定药物个体化用量得途径，使用不同得诱导剂可产生不同得结果。从临床用药安全性监测角度考虑，氯吡格雷监测以ADP诱导MAR为佳，阿司匹林调整理想剂量得指标应重视AA诱导MAR，该测定可能就是监测阿司匹林抵抗与出血得最佳途径，当阿司匹林将AA完全阻断，可能出现AA诱导MAR低于5%，而ADP诱导MAR仍在40%左右，阿司匹林抵抗与出血可能产生，当深入研究。
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