考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.ppt

考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量(hnling)(hnling)第一页，共十一页。实验实验(shyn)(shyn)目的目的n n了解(li(li oji)oji)考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理n n掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤第二页，共十一页。实验实验(shyn)(shyn)原理原理n n考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，595nm处的光密度值与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋白质定量(dngling)(dngling)测定。第三页，共十一页。仪器(yq)(yq)和试剂n n1 1仪器：分析天平；吸管仪器：分析天平；吸管0.1ml10.1ml1、1ml21ml2、5ml15ml1；试管；试管1010个；个；722722型分光光度计；容量瓶型分光光度计；容量瓶100ml100ml、1000ml1000ml各一个；各一个；n n2 2试剂：试剂：（1 1）0.9%NaCl0.9%NaCl溶液；溶液；（2 2）标准蛋白质溶液：称取）标准蛋白质溶液：称取10mg 10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至水并定容至100ml100ml，制成，制成0.1mg/ml 0.1mg/ml 的原液。的原液。（3 3）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝G-250G-250（0.01%0.01%）染液：称取）染液：称取0.1g0.1g考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250，溶于，溶于50ml 90%50ml 90%乙醇中，加入乙醇中，加入85%85%（m/vm/v）的磷酸）的磷酸100ml100ml，最后最后(zuhu)(zuhu)用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至1000ml1000ml。此溶液不宜久存，在常温。此溶液不宜久存，在常温中可放置中可放置1-21-2个月。个月。（4 4）样品液：取牛血清白蛋白）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 0.1mg/ml 的溶液，用的溶液，用0.9%0.9%NaClNaCl溶液稀释至一定浓度。溶液稀释至一定浓度。第四页，共十一页。操作步骤n n10100gmL标准曲线的制作(zhzu)(zhzu)：取6支试管，编号后，按下表加入试剂，混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照，在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量（g）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。第五页，共十一页。管号123456蛋白质标准液（ml）00.10.10.10.10.10.9%NaCl溶液（ml）1.00.90.90.90.90.9考马斯亮蓝染液555555蛋白质含量（g）A595 第六页，共十一页。n n2样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适(hsh)(hsh)浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。第七页，共十一页。计算计算(j sun)(j sun)样品(yngp(yngp n)n)的蛋白质含量（g/g鲜重）=查得的蛋白质含量（g）/样品(yngp(yngp n)n)鲜重（g）第八页，共十一页。注意事项注意事项n n1.如果要求严格，最好在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。n n2测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，不可使用石英(shyng)(shyng)比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。第九页，共十一页。思考题 n n1 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点？n n2根据(gnj)(gnj)下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。（1）样品不易溶解，但要求结果较准确；（2）要求在短时间内测定大量样品。（3）要求很迅速地测定一系列试管（如30支）中溶液的蛋白质浓度。第十页，共十一页。内容(nirng)总结考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态(zhungti)呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最大吸收波长由465nm转变为595nm。吸管0.1ml1、1ml2、5ml1。（2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。（4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用0.9%NaCl溶液稀释至一定浓度第十一页，共十一页。