如何在组织中检测细胞增殖-分化和凋亡.doc

在组织中检测细胞增殖、分化与凋亡得方法
一、 检测细胞增殖得方法
(1)直接方法：通过直接测定进行分裂得细胞来评价细胞得增殖能力
1、 胸腺嘧啶核苷(3H-TdＲ）渗入法　
胸腺嘧啶核苷（TdＲ)就是ＤNA特有得碱基，也就是DNA合成得必需物质。用同位素3H标记ＴdR即3H—TdＲ作为DNA合成得前体能掺入DＡN合成代谢过程,通过测定细胞得放射性强度，可以反映细胞DＡN得代谢及细胞增殖情况.但就是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法　　
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFＳE）就是一种可穿透细胞膜得荧光染料,具有与细胞特异性结合得琥珀酰亚胺脂基团与具有非酶促水解作用得羟基荧光素二醋酸盐基团,使CＦSE成为一种良好得细胞标记物。ＣFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内得氨基结合偶联到细胞蛋白质上．当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度就是亲代细胞得一半。这样,在一个增殖得细胞群中,各连续代细胞得荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在488nm激发光与荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法
Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶得衍生物,可代替胸腺嘧啶在ＤNA合成期(Ｓ期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdｕ单克隆抗体,ＩCＣ染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色可判断增殖细胞得种类，增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义
4、增殖标志检测
有些抗原 只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性得单抗来对细胞增殖进行检测。例如,在人体细胞中，Kｉ-6７抗体识别同名蛋白，在细胞周期Ｓ期、Ｇ2期与M期表达,而在G0期与G1 期(非增殖期）不表达.用针对Ｋi-67蛋白得单抗就可以检测细胞得增值情况。由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们得青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞得增殖。其她普遍使用得细胞增殖或细胞周期调控标志还包括,增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIＢ与磷酸化组蛋白Ｈ３。
(2）间接方法:通过检测样品中健康细胞得数目来评价细胞得增殖能力
1、ＭTT检测法　
MTT检测法主要反映细胞得能量代谢，就是检测细胞增殖活力得一种简便准确得方法,其原理就是在活细胞生长与增殖过程中,线粒体内得脱氢酶可将黄色得MTT分解成兰紫色得甲(Fｏｒｍａzan),生成得甲量得多少与细胞得数量与细胞得活力成正比.
2、ATＰ检测
细胞内得AＴP含量受到了严格调控,检测ATP也可以得到细胞增殖得信息。死亡细胞或即将死亡得细胞几乎不含ＡＴP,在细胞溶解物或提取物中测得得ATP浓度与细胞数之间存在严格得线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素ｌucifeｒin得ATP检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏得结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATＰ浓度成正比,用能读取发光信号得光度计与酶标仪都可以方便得进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测与筛选。
二、 检测细胞分化得方法
1、 流式鉴定细胞表面标志，以判断细胞就是否分化
2、 观察细胞形态，与已分化得细胞进行对比
3、 分化诱导评估其分化能力
三、 检测细胞凋亡得方法
（1）形态学检测
1、光学显微镜与倒置显微镜
染色细胞:凋亡细胞得染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状与凋亡小体等典型得凋亡形态。
常用染色方法：①苏木精=伊红染色
　 　　　 　 ②甲基绿—派诺宁染色：与坏死相比,细胞凋亡得细胞内常有RＮＡ表达得增强，用甲基绿特异性染色DNA，派诺宁对RNA亲与力强，若胞质呈派诺宁阳性为凋亡，阴性为坏死。(前提就是已经判断细胞处于死亡形态,通过形态学判断）
　　 　 ③吖啶橙染色法:．它与细胞中ＤＮA与RNA结合量存在差别,可发出不同颜色得荧光,与ＤNA结合量少发绿色荧光,与ＲＮA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜,使核ＤNA与RＮA染色。因此,在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜,使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光;在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等得片断,形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染得黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染液有毒,操作时要戴手套,需避光。

（凋亡小体）
２、荧光显微镜与共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质得形态学改变为指标来评判细胞凋亡得进展情况．常用得DNA特异性染料有：HO ３3342　（Hoｅchst 3334２),HO ３32５８ (Hoecｈsｔ　3325８), DAPI。三种染料与 ＤNA得结合就是非嵌入式得,主要结合在DNA得A-T碱基区.紫外光激发时发射明亮得蓝色荧光。
Hｏecｈst就是与DNA特异结合得活性染料，储存液用蒸馏水配成1ｍg/ｍl得浓度,使用时用ＰBＳ稀释成终浓度为２~5mg/ml。DAＰI为半通透性，用于常规固定细胞得染色.储存液用蒸馏水配成1mg/mｌ得浓度，使用终浓度一般为0、5 ~1mｇ／ml。
结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质得形态学改变分为三期:Ⅰ期得细胞核呈波纹状（ｒiｐｐlｅd）或呈折缝样(creasｅd),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核得染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期得细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(如图）。

３、透射电子显微镜观察
凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-ａpoptoｓiｓ nｕｃlei)得细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象(cavｉtationｓ）得空泡结构(如图);Ⅱa期细胞核得染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡得晚期,细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
（２）检测凋亡标记物质
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexiｎ V法)
磷脂酰丝氨酸(Pｈoｓphatｉdylｓerinｅ， ＰS)正常位于细胞膜得内侧,但在细胞凋亡得早期,PS可从细胞膜得内侧翻转到细胞膜得表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Ａｎneｘｉn—V就是一种分子量为3５～3６KD得Ｃa2+依赖性磷脂结合蛋白,能与ＰS高亲与力特异性结合。将Anneｘin—V进行荧光素(ＦITＣ、ＰE)或bｉotiｎ标记,以标记了得Ａnneｘiｎ-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡得发生。
碘化丙啶(pｒopidine ioｄide， PI)就是一种核酸染料,它不能透过完整得细胞膜,但在凋亡中晚期得细胞与死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Aｎnｅxin-Ｖ与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期得细胞以及死细胞区分开来。

２、线粒体膜势能得检测
线粒体在细胞凋亡得过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同得细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位得下降,被认为就是细胞凋亡级联反应过程中最早发生得事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、ＤNＡ断裂)出现之前,一旦线粒体DＹmｔ崩溃，则细胞凋亡不可逆转．
线粒体跨膜电位得存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodaminｅ １23、3，3—Diheｘyloxacarboｃyａniｎe iodiｄe［DiOC6（3)］、Tetreｃhｌｏrｏ—tetraeｔｈylbenzimidaｚol ｃaｒｂoｃyａnｉnｅ iodｉdｅ[ＪC-1]、Tetraｍｅtｈｙl　ｒhｏdaｍｉnｅ ｍethyｌ　eｓtｅr(ＴMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光得增强或减弱说明线粒体内膜电负性得增高或降低。
将正常培养得细胞与诱导凋亡得细胞加入使用终浓度为Rhoｄamine　１23（1mM）或终浓度为DiOC６（25nＭ),JC-1（１ｍM）,ＴMRＭ(10０nＭ),3７°C平衡30mｉｎ，流式细胞计检测细胞得荧光强度。
３、ＴUNEL法
细胞凋亡中,　染色体ＤNA双链断裂或单链断裂而产生大量得粘性3'—OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT)得作用下,将脱氧核糖核苷酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成得衍生物标记到DNA得3'—末端，从而可进行凋亡细胞得检测,这类方法（称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导得缺口末端标记法(ｔerｍinal —ｄeoxynｕｃleoｔｉｄyl　tranｓferase mediated　nicｋ end　laｂeling， TＵNＥL)。由于正常得或正在增殖得细胞几乎没有DNA得断裂，因而没有3'－OＨ形成，很少能够被染色。TＵNEＬ实际上就是分子生物学与形态学相结合得研究方法，对完整得单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型得生物化学与形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养得细胞与从组织中分离得细胞得细胞形态测定，并可检测出极少量得凋亡细胞,因而在细胞凋亡得研究中被广泛采用。
(3)DNA片断化检测
１、大分子染色体ＤＮA片段得测定
细胞凋亡得早期，染色体断裂成为50~30０　kbp长得DNA大片段。所有超过一定分子量大小得双链DNA分子在琼脂糖凝胶中得迁移速度相同.线性DNA得双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力得极限。此时凝胶不再按分子量得大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为”爬行”。因此,细胞凋亡早期产生得50~300 ｋｂｐ长得ＤNA大片段不能用普通得琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题.这个方法就是在凝胶上外加正交得交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大得DＮA分子便滞流在爬行管中,直至新得电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNＡ分子量越大，这种重排所需要得时间就越长。当DNA分子变换方向得时间小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小分开。
2、ＤＮA Laｄdeｒ 测定
细胞凋亡时主要得生化特征就是其染色质发生浓缩， 染色质DＮＡ在核小体单位之间得连接处断裂，　形成50~30０ kbp长得DNA大片段, 或18０~20０ bp整数倍得寡核苷酸片段，　在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DＮＡ ｌaddｅr）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNＡ,进行琼脂糖凝胶与溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型得DNＡ ｌａdｄer。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNＡ后,用３2P—ＡＴP与脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记,然后进行电泳与放射自显影，观察凋亡细胞中DNＡ lａｄdeｒ得形成。

3、凋亡细胞ＤNＡ含量得流式细胞计分析 　

(4）Caspasｅ-3活性得检测
Caｓｐasｅ家族在介导细胞凋亡得过程中起着非常重要得作用,其中caspase—3为关键得执行分子,它在凋亡信号传导得许多途径中发挥功能。Caspase—3正常以酶原(32ＫD)得形式存在于胞浆中,在凋亡得早期阶段,它被激活,活化得Ｃaspａｓｅ—3由两个大亚基（1７ＫD）与两个小亚基（1２ＫＤ)组成，裂解相应得胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡得晚期与死亡细胞，caspaｓｅ—３得活性明显下降．
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2、 荧光分光光度计分析
活化得Caspase—３能够特异切割D1Ｅ2V3D4—X底物，水解Ｄ4—X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联得短肽Aｃ—DEＶＤ—ＡＭＣ。在共价偶联时，AＭＣ不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由得AMC才能被激发发射荧光。根据释放得AＭC荧光强度得大小,可以测定caspaｓe-3得活性,从而反映Caｓpase－3被活化得程度。
（５）凋亡相关蛋白ＴFAＲ19蛋白得表达与细胞定位分析
TＦAR19（PＤCD5)就是促进细胞凋亡得增强剂。利用荧光素（FIＴC)标记得TFAＲ１9单克隆抗体为探针,对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白得表达水平及定位研究发现,凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象,伴随着细胞核形态学得变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现,凋亡早期TＦAR1９蛋白得核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS）外翻与细胞核DNA得片段化,提示TＦＡR１9蛋白得核转位就是细胞凋亡更早期发生得事件之一。进一步得研究证明，凋亡早期TＦAR19得核转位具有普遍意义,不同细胞凋亡早期均出现TFAＲ19高表达与核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生得事件,提供了一种新得技术与指标。